【科研实操经验分享】石蜡包埋组织的免疫荧光染色方法

辛辛苦苦养了几个月的小鼠，石蜡切片终于做好了，兴冲冲拿去拍共聚焦，结果——要么一片漆黑啥也看不见，要么背景亮得比夜空还晃眼。

如果你经历过这种崩溃，那这篇推文就是为你写的。

我们从原理→试剂→操作→避坑，把石蜡切片免疫荧光的每一步拆开揉碎，连封闭液怎么配都写得明明白白，帮你下次一次出图。

免疫荧光染色（Immunofluorescence, IF）是科研中用来观察蛋白定位、多蛋白共定位的高频实验。看似流程简单，但抗原修复、避光、一抗二抗选择、封片每一步出错，都会直接导致实验报废。本篇从原理、试剂准备、完整操作流程、踩坑要点全部讲透，带你搞定石蜡切片免疫荧光实验。

IF是病理分子检测的重要技术，其原理是抗原与抗体的特异性结合：用荧光素标记的二抗示踪目标抗原，在荧光/共聚焦显微镜下检测荧光信号，从而确定目标抗原的表达与定位。可同时标记多种荧光，实现多个靶蛋白的共定位分析。

一、实验前期准备：材料与器材

材料：PBS磷酸盐缓冲液、BSA、Triton X-100、山羊血清、PBST、梯度酒精、环保脱蜡液、柠檬酸盐修复液、一抗、荧光标记二抗、含DAPI的抗荧光淬灭封片剂

器材：防脱（粘附）载玻片、盖玻片、湿盒、摇床、4℃冰箱、组化笔、荧光共聚焦显微镜

二、染色流程

1.组织脱蜡

将组织切片放在60–65℃烘箱中放置1–2h（必要时可过夜，但长时间高温可能损失抗原性，常规以1–2h为宜），使组织切片表面的蜡融化。烘箱中取出后分别放入环保脱蜡液I和环保脱蜡液II中各脱蜡10–15min。

2.组织复水

依次在100%乙醇溶液I、100%乙醇溶液II、95%乙醇溶液、80%乙醇溶液、75%乙醇溶液中复水，每个缸各5min。随后用蒸馏水（或去离子水）浸洗1–2次，每次3–5min，再转入PBS磷酸盐缓冲溶液中清洗3次，5min/次。

3.抗原修复

将组织转移至柠檬酸盐修复液（pH=6.0）中，用微波炉高火加热至沸腾后，转中低火维持亚沸腾状态10–15min（亦可采用”中火8min—停火8min—中低火7min”的间歇加热方案）。修复完成后自然冷却至室温（切勿骤冷或流水冲凉，以免脱片）。修复过程中注意修复液液面始终没过切片，防止蒸干。待组织切片冷却至室温后，在PBS磷酸盐缓冲液中清洗3次，5min/次。

4.封闭

清洗完成后，将组织周围的水擦去（注意组织本身不可干燥），用免疫组化笔在组织周围画上阻水圈，将组织放在湿润的孵育盒中并在组织上滴加5%BSA封闭液，在室温下封闭1h。

（5% BSA封闭液配制：用天平称量0.5g BSA粉末，溶于10mL PBS磷酸盐缓冲液中，加入500μL山羊血清及10μL Triton X-100，吹打混匀）

配方使用前提：①封闭用血清的种属必须与所用二抗的宿主种属一致（如二抗为羊抗兔，则用山羊血清；若二抗宿主为驴、兔等，应换用相应种属血清，否则反而引入背景）；②Triton X-100 在此起透化作用，适用于胞内/核内抗原；若检测膜蛋白或膜近端表位，应慎用或降低其浓度，以免破坏膜结构、改变膜蛋白定位。

5.孵育一抗

封闭结束后，甩去组织上的封闭液后在组织上滴加预先配制的一抗，盖上封口膜，在4℃环境下孵育过夜（湿盒内应加水保持湿度，防止抗体蒸发）。

6.二抗

一抗孵育结束后，置于PBS磷酸盐缓冲液中清洗3次，5min/次。清洗完成后，在组织上滴加一抗对应种属的荧光二抗（稀释后建议4℃高速离心数分钟取上清使用，以去除抗体聚集体、减少颗粒状荧光背景，盖上封口膜，在室温下避光孵育1h。孵育结束后，置于PBS磷酸盐缓冲液中清洗3次，5min/次。自加入荧光二抗起，之后的所有步骤（洗涤、封片、保存、观察）均须全程避光。

7.封片

轻轻甩去多余水分（保留极少量PBS以防干片），在组织上滴加含有DAPI的抗荧光猝灭剂后盖上盖玻片封片（避免气泡），室温避光静置使封片剂固化（部分产品需避光固化约24h），或用指甲油封边后4℃避光保存。

8.观察结果封片后应尽快在共聚焦显微镜下拍摄观察（建议24–48h内完成，4℃避光最长可保存数周，但荧光会随时间衰减）

三、注意事项⚠️

1、避免气泡：在封片过程中，需要避免产生气泡。气泡会干扰显微镜下的观察，影响实验结果的准确性。因此，在封片时，需要缓慢封片。

保持避光和湿度：二抗孵育开始至封片观察结束，全过程必须严格避光（包括洗涤环节）。封片后，需要将标本放置在避光、4℃的环境中保存。

2、避免交叉反应：对于多重染色，一方面需要选用发射光谱互不重叠的荧光染料，规避光谱串扰，防止不同靶标信号互相干扰造成结果误判；另一方面多重染色的一抗必须来源于不同物种，避免二抗发生交叉反应。

组织脱片：需要使用防脱载玻片（多聚赖氨酸或APES包被）、烤片需要充分、避免抗原修复后急速降温。

3、避免非特异性染色：一抗孵育时间不宜过长，浓度不宜过高。尽量选择单克隆抗体。同时应设置阴性对照（省略一抗），以评估二抗非特异性结合与组织自发荧光。

4、洗涤条件所有PBS/PBST洗涤建议在摇床下进行，且保证液体完全浸没组织

四、常见问题Q&A

Q1：一抗孵育能不能不做过夜、缩短时间？

可以室温孵育2h，但信号强度通常不如4℃过夜。如果一抗效价高、抗原丰度高，可以尝试，否则建议按标准过夜。

Q2：洗涤用PBS还是PBST？

推荐PBST（含0.1% Tween-20），去污能力更强，洗涤更干净。但要注意Tween-20浓度不能太高，洗涤液中Tween-20常用浓度为0.05%–0.1%；浓度过高会导致过度透化、洗脱弱结合的抗体使信号下降、并增加脱片风险，而非笼统的”损伤组织”。

Q3：为什么我的阳性对照有信号、实验组没有？

检查目标蛋白是否真的在该组织/条件下表达（查文献确认）；一抗是否适用于石蜡切片（有些抗体只适用于WB或冰冻切片，购买前需确认说明书中是否标注IHC-P/IF-P应用）

提醒- 本文仅供科研交流，具体操作请结合课题需求优化参数。

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