Angew｜中国药科大学董廖斌/南京大学梁勇团队通过半理性工程重编程P450酶区域选择性，实现五环三萜B环选择性功能化

导读

中国药科大学董廖斌教授和南京大学梁勇教授团队此前报道了细菌来源的P450酶ApPT，该酶能催化18β-甘草次酸（GA）C7β位羟基化并经1,5-氢原子转移（1,5-HAT）实现C15α位羟基化（Nat. Chem. 2026, 18, 1133）。近日，该团队在Angewandte Chemie International Edition上报道了通过蛋白质工程对ApPT活性口袋进行半理性改造，获得四重突变体MB4（T291I/T288G/S289Q/G290E），将C7β羟基化的区域选择性从29%提升至>99%，阻断了后续1,5-HAT接力氧化。在此基础上，作者以酶催化产物为起点开展化学-酶法合成，制备了一系列B环修饰的五环三萜衍生物，其中多个化合物对前列腺癌PC-3细胞表现出亚微摩尔级的增殖抑制活性。

第一作者：张晓维、王亚鑫、陈红威

通讯作者：梁勇 教授、董廖斌 教授

通讯单位：中国药科大学、南京大学

论文DOI：10.1002/anie.2096522

研究策略概览

研究背景

甘草次酸骨架上有44条C–H键（21条伯碳、18条仲碳、5条叔碳），其中B环上的C–H键缺少便于导向的官能团，传统催化方法难以实现选择性修饰。然而，obeticholic acid等分子的构效关系表明，B环取代基的变化可以影响生物活性。已有报道中通过化学合成实现五环三萜B环C–H活化的路线需要12步，总产率不足3%，且非对映选择性不理想，制备工具的缺乏限制了这一区域的构效关系研究。

该团队此前发现的P450酶ApPT能催化GA的C7β位羟基化，但随后经1,5-HAT接力氧化生成C7β,C15α-双羟基产物，最终产物是C7单羟基产物1a和双羟基产物1b的混合物（2 mM底物浓度下1a占约29%）。要将C7β-OH用作B环衍生化的合成起点，需要选择性获得1a。

图1. 五环三萜B环C–H功能化的策略与挑战

酶的半理性改造策略

作者首先通过底物筛选考察了A环取代基对选择性的影响。将GA的C3位羟基分别乙酰化和丙酰化后，1a:1b的比值从39:61（底物1，C3-OH）变为91:9（底物2，C3-OAc），丙酰化底物3几乎只生成1a但产率降至61%。MD模拟表明，在ApPT与底物1的复合物中C15到Cpd I氧原子的距离为4.8 Å，而与底物2的复合物中该距离拉长至7.3 Å。这些结果提示A环附近的空间约束影响底物取向和氧化产物分布，作者据此提出通过改造该区域口袋残基来调节选择性。

基于上述分析，作者采用聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）和饱和突变（SSM）策略，以底物1的A环4 Å范围内的残基T288、T291、G292和L293为突变位点开展酶工程研究。

第一轮丙氨酸扫描筛出热点残基T288、T291和G292，其中T291I（MB1）以81%选择性和75%产率成为后续迭代母本。第二轮在MB1基础上引入T288G或T288A突变，生成双突变体MB2-1（83%选择性）和MB2-2（85%选择性）。第三轮注意到所有热点残基均位于K-螺旋与β3-折叠之间的loop区域，在S289和G290位点做饱和突变：S289Q（MB3-1）将选择性推至93%，G290E（MB3-2）使总氧化产率升至>99%但C7选择性降至70%。第四轮组合最优突变，获得四重突变体MB4（T291I/T288G/S289Q/G290E），C7选择性>99%，产率85%。

图2. 半理性工程ApPT实现C7选择性羟基化的策略与结果

高催化选择性的结构与机制解析

作者通过种晶法获得了MB4的晶体结构（PDB: 9U5Y，分辨率2.3 Å）。MB4与野生型ApPT（PDB: 8W7G）的总体折叠高度一致（323个Cα原子RMSD约0.2 Å），但288–291位残基所在的loop向活性位点方向下沉了约3.4 Å，改变了底物结合口袋的形状。MD模拟显示，MB4中C7到Cpd I氧原子的距离为3.3 Å（野生型3.6 Å），C15到氧原子距离为4.9 Å，提示底物构象更有利于C7位氧化。

DFT计算给出C7和C15位羟基化的固有能垒分别为10.9和13.1 kcal/mol。结合自由能分析表明，MB4对C7羟基化过渡态具有1.9 kcal/mol的稳定作用，而对C15羟基化过渡态则产生10.5 kcal/mol的去稳定作用。因此，将底物结合效应纳入后，C7和C15位羟基化的有效能垒分别为9.0和23.6 kcal/mol。对于后续1,5-HAT，野生型ApPT的反应能垒为12.6 kcal/mol，而MB4中该能垒升高至22.7 kcal/mol，增加了10.1 kcal/mol。计算结果表明，MB4的活性口袋与产物1a形成了更强的氢键网络（残基Q81、Q289、E290参与），这种产物结合模式提高了由C7向C15发生1,5-HAT的能垒，从而阻断了接力氧化过程。

图3. ApPT与MB4的晶体结构比对与催化机制解析

底物范围与克级制备

作者考察了MB4的底物范围。对于甘草次酸的A环衍生物，无论引入酮基、α,β-不饱和酮，还是将A环扩展为七元内酯，MB4均可实现C7β位羟基化，产率为77%–98%。当侧链取代基体积增大时，反应效率明显下降，例如异噁唑衍生物7和丙酰化衍生物3的产率分别降至56%和<1%。C环修饰对反应同样具有一定影响，共轭二烯衍生物8和12-氧代-9(11)-烯衍生物9的产率分别为30%和42%。值得注意的是，将底物羧酸分别转化为甲酯、苄酯或己烯酯后，产率均降至10%以下，表明游离羧酸在MB4的底物识别与高效催化中具有重要作用。此外，对乌苏烷型和羽扇豆烷型底物，MB4亦有催化活性（产率37%和31%），但羟基化发生在A/C环。

在放大制备中，MB4以粗酶裂解液催化6.5 g底物1，产物1a分离产率81%，未检测到C15位副产物；进一步使用冻干酶粉催化13.3 g底物，1a的分离产率达86%。

图4. MB4的底物范围与克级制备

化学-酶法合成与生物活性评价

作者以巴多索隆（bardoxolone）药效团设计思路为参照，以产物1a为起点合成了含A环氰基烯酮、C环烯酮和B环C7-OH的关键中间体19（结构经单晶X射线衍射确认）。在此基础上对C7-OH进行多样性转化：DAST处理得到8α-氟代物20（67%）和烯烃衍生物21（30%），IBX氧化得到C7酮22，酸酐酰化得到C7酯系列23–31。

抗增殖活性评价在HCT116、MCF-7、HepG2、A549和PC-3五种肿瘤细胞系上进行，以CDDO-Me和不含B环修饰的母体化合物32为对照。C7酮22活性较低（IC50 > 20 μM），而C7酯衍生物中，异戊酰基29、对甲苯甲酰基30和对氯苯甲酰基31对PC-3细胞的IC50分别为0.39、0.37和0.31 μM（CDDO-Me：0.83 μM，母体32：1.09 μM）。机制研究表明，29–31以剂量依赖方式诱导PC-3细胞凋亡，激活caspase-3并引起PARP切割，同时诱导G2/M期阻滞。

图5. B环修饰五环三萜衍生物的化学酶法合成

图6. B环修饰衍生物的抗肿瘤活性与构效关系

总结

该研究首先结合底物结构分析与MD模拟，揭示了A环取代基对ApPT C7/C15氧化选择性的影响，据此通过四轮FRISM/SSM工程改造获得四重突变体MB4，将C7β选择性从29%提升至>99%。晶体结构和DFT计算表明MB4通过重塑活性口袋loop区域，一方面优化底物构象以促进C7羟基化，另一方面显著提高后续1,5-HAT接力氧化的能垒，从而将反应停留在C7β羟基化阶段。MB4具备十克级制备能力（冻干酶粉催化13.3 g底物，86%产率），酶催化生成的C7β-OH被用于化学-酶法合成一系列B环修饰衍生物，其中大体积疏水酰化衍生物29–31的PC-3细胞增殖抑制活性（IC50 0.31–0.39 μM）优于CDDO-Me。从催化机制解析、酶工程改造到规模化制备和药物化学拓展，该研究建立了由选择性C–H活化启发的五环三萜结构改造模式，为复杂天然产物的后阶段修饰及活性分子发现提供了新的思路。

文献详情

Zhang, X.; Wang, Y.; Chen, H.; Liu, C.; Pan, X.; Li, L.; Xu, H.-M.; Liang, Y.*; Dong, L.-B.* Redirecting Regioselectivity in Cytochrome P450 ApPT for B‑Ring Functionalization of Pentacyclic Triterpenoids. Angew. Chem. Int. Ed. 2026. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.2096522

通讯作者简介

董廖斌，中国药科大学教授、博士生导师。课题组聚焦天然产物生物合成与合成生物学研究，致力于发展新型生物催化工具用于复杂天然产物的结构修饰与药物先导化合物发现。

梁勇，南京大学化学化工学院教授、博士生导师。研究方向涵盖配位化学、有机金属催化及计算化学等领域。