Nature | 长读长测序揭示精子一部分非交叉重组基因转换事件发生在减数分裂之前

撰文|章台柳

在减数分裂重组中，程序性DNA双链断裂（DSBs）的修复引起了同源染色体之间的遗传物质交换。这一过程的精确执行对于维护许多生物体的基因组完整性及生育力至关重要。在人类及许多其他脊椎动物中，减数分裂DSB的产生是通过锌指蛋白PRDM9的序列特异性结合来进行定位的。这些DSBs中只有少数消退为交叉重组（crossovers,COs），导致重组位点两侧等位基因的相互交换；而绝大多数DSBs则消退为非交叉重组（non-crossovers,NCOs），并伴随着短区间内遗传信息的单向转移（基因转换）。此外，还观察到了少量的复杂重组事件，其数量远少于简单的COs和NCOs。

人们普遍认为，生殖系NCOs与COs类似，源于减数分裂中SPO11诱导的DSBs，但已知NCOs的精细图谱与COs不同，且基因转换也发生在体细胞组织中。事实上，重组是非减数分裂细胞中DSB修复的重要组成部分，它允许在修复过程中使用同源序列作为模板。关于减数分裂重组的大部分知识来自于家系和基于人群的统计学方法，但这些方法在每位个体中捕获的事件数量有限，或者依赖于关于人口统计学、突变率和选择中性的简化假设。更直接地，可以对来自单个个体的大量精子细胞进行测序，其中每个精子代表一次独立的减数分裂。早期的精子测序分析通过PCR定向针对重组热点，且仅限于少数基因座；而较新的单细胞方法允许在全基因组范围内了解COs，但对NCOs缺乏分辨率。最近，跨越多个杂合标记的高精度长读长精子测序实现了CO事件的直接可视化，但要可靠地检测NCOs则需要极高准确率，以避免与测序错误相混淆。

近日，来自桑格研究所的Raheleh Rahbari和Richard Durbin合作在Nature杂志上发表文章Long-read sequencing reveals pre-meiotic gene conversion in sperm，利用高精度的长读长PacBio CCS测序技术对来自13名捐赠者的混合精子进行测序，在全基因组范围内鉴定COs和NCOs，揭示了与体细胞组织共享的显著的减数分裂前NCO组分、个体间的变异，并改进了对NCO片段长度的表征。共鉴定出 2,382个候选非交叉重组，并鉴定出一个具有不同于PRDM9诱导重组特性的稳定成分。这一现象与通过DMC1结合鉴定的减数分裂双链断裂位点、交叉重组图谱或 GC 偏向的基因转换无关，而是与基因组脆弱位点相关。在家系数据中，父系非交叉重组基因转换也同样观察到了这一成分。将相同的分析应用于12份血液样本，观察到了具有类似特性的非交叉重组基因转换，但交叉重组事件却极少。此外，不同重组类型在捐赠者之间存在变异，即使他们拥有相同的PRDM9基因型也是如此。即在精子中观察到的相当一部分非交叉重组基因转换事件发生在减数分裂之前。

从13名捐献者（年龄在24-74岁之间）获取了15份精子样本，其中包括一对同卵双胞胎以及2名在2个不同时间点采样的个体。10名捐献者为PRDM9等位基因PRDM9A的纯合子，其余捐献者为PRDM9A与PRDM9B、PRDM9D或某种新等位基因杂合的杂合子。在Pacific Biosciences Sequel II和Revio测序仪进行测序，每份精子样本的序列覆盖度范围为17X至 159X（平均为78.2X），平均读长为13,160 bp，总共获得了267,461,560条reads。为了确保准确的比对并避免参考偏差，使用hifiasm为每个个体组装了单倍型解析的从头组装，产生了两组染色体序列（单倍型）。然后，将每条读段分别比对到其捐赠者的两个单倍型上，仅保留196,296,004条明确比对到两个单倍型并满足其他质控的读段用于进一步分析。在每条读段上识别出候选单核苷酸变异（SNV），即与一个单倍型匹配但不与另一个匹配的碱基。在去除碱基质量低、低复杂度区域、串联重复或比对到读段稀少的单倍型区域的SNV后，在所有读段中共产生1,163,633,539个SNV，平均每个读段5.9个SNV。按照定义，每条等位基因匹配两套单倍型中的其中一套。如果一条读段同时携带两套单倍型的等位基因，并且满足多项额外质控标准，则将其标记为候选重组读段。候选读段标记规则如下：若读段包含一处交换，且交换两侧至少各有两个支持该交换的SNV，标记为 “CO”；发生两次交换标记为 “NCO”；发生三次及以上交换标记为 “complex（复杂事件）”；仅发生一次交换，但支持的 SNV 数量不足（仅单侧存在 SNV），标记为 “ambiguous（存疑）”。最终所有精子样本共识别7143个CO、2382个NCO、219个复杂事件以及7585个存疑事件。

进一步分析显示，即使在精子中，也能观察到有丝分裂和减数分裂重组过程的产物，这些重组源于受精卵到减数分裂阶段之间发生的双链断裂（DSB）修复。同时观察到相当一部分精子NCO事件远离减数分裂CO热点，且与脆性位点相关；血液样本中也存在对应的同类事件。这与相当一部分精子NCO来源于减数分裂前修复这一结论相符。精子中存在减数分裂前NCO类事件，一部分原因可能是：相较于DSB‑PRDM9位点处的CO事件以及雄性遗传图谱，精子样本中NCO事件会出现衰减。综合精子与血液数据，以及对deCODE数据集的分析，这类非减数分裂NCO基因转换不存在显著的GC偏好，这也解释了Palsson等人在男性受试者中观察到较低水平的gBGC（61.9%），而女性受试者水平更高（65.5%）这一现象。

通过多种途径估算来源于减数分裂前过程的NCO占比，基于遗传长度分布，由DSB‑PRDM9重叠区估算得到该比例约45%；由GC偏好差异估算得到41%。基于 deCODE数据，分别利用遗传长度分布、GC偏好差异进行估算，得到该比例约 23%。综合所有估算，保守估计减数分裂前来源的NCO占比约25%‑33%，每枚精子约存在0.6个可检测的此类事件。此外，NCO特征的个体差异并不能完全由PRDM9基因型解释。尤其是同卵双胞胎样本之间也检测到差异，这说明随机因素与环境因素对减数分裂重组可产生显著影响。

总的来说，研究对13名捐献者的混合精子样本开展高准确度PacBio CCS长读长测序，在全基因组范围内鉴定交叉互换（CO）与非交叉互换（NCO）事件，并揭示出精子中存在大量减数分裂前来源的NCO组分，该组分在体细胞中同样存在。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10901-0

制版人： 十一

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