两篇Science | 诺奖得主Doudna揭示CRISPR起源的VIPR系统，解析"非连续"RNA引导DNA识别机制

撰文 | 格格

RNA引导系统通过引导RNA与靶标的连续碱基互补配对实现可编程识别，广泛介导从移动遗传元件传播到适应性免疫的多种功能；在CRISPR-Cas系统中，这一机制赋予原核生物适应性免疫，并催生了跨越所有生命域的生物技术工具。CRISPR-Cas依据效应蛋白分为两类，其中更为丰富的Class 1被认为最早演化出来【1】，其标志性特征是含有重复序列相关神秘蛋白（RAMP），这些蛋白在CRISPR RNA上寡聚化形成RNA引导的效应复合物，是CRISPR-Cas中最保守的组分，据推测可追溯至最后通用共同祖先【2】。然而，尽管适应模块已明确追溯至casposons转座子，Class 1多亚基效应复合物的起源仍然模糊，其从何种古老蛋白演化而来、如何获得RNA引导功能均缺乏直接证据；同时，即使对于已表征的CRISPR-Cas系统，靶标搜索与识别的基本物理机制仍存争议，R-loop形成的可逆性意味着完全匹配靶标的识别概率可能极低，一维扩散的贡献程度与超螺旋的调控作用尚未澄清；此外，RAMP蛋白虽共享RNA识别基序，但不同亚型中Cas7结合crRNA的扭转角差异显著，导致螺旋节距变化，这种结构可塑性与功能特异性的关系仍待阐明。

近日，Science杂志同期发表了两项来自诺贝尔化学奖得主、加州大学伯克利分校Jennifer Doudna团队的研究成果：A noncontiguous code for RNA- guided DNA recognition at the origin of CRISPR- Cas和VIPR RNA- guided DNA recognition by noncontiguous geometric triplex formation。两项工作旨在通过鉴定祖先型RAMP追溯CRISPR-Cas的演化起源，并由此发现了采用GGY/NN交替基序与“跳碱基”规则进行非连续配对的噬菌体VIPR系统，进而通过21个冷冻电镜结构揭示了其以右手螺旋丝组装、经几何三链体实现非连续RNA引导DNA识别的分子机制。

在第一项工作中，为了探寻CRISPR-Cas的演化起源，研究人员利用RAMP蛋白共享的结构特征（RRM核心、G-loop和拇指结构域）进行结构相似性搜索，发现了一个此前未报道的大规模RAMP同源蛋白家族，并将其所在系统命名为VIPR（病毒干扰可编程重复）系统。该系统极为精简，通常仅编码Vipr蛋白和辅助蛋白Vap，主要存在于噬菌体和古菌病毒基因组中，而非细胞基因组。系统发育分析表明，Vipr蛋白形成独立于所有CRISPR RAMP的早期分支，且缺乏CRISPR RAMP的衍生特征，提示其代表在CRISPR RAMP辐射之前就已分化的祖先型RAMP谱系。小RNA测序鉴定出约100 nt的vrRNA，与Vipr蛋白共纯化形成稳定复合物；序列分析揭示vrRNA由9至16个YNNGG串联重复组成，形成交替的保守GGY基序与高变NN二核苷酸。基于Class 1 CRISPR中拇指结构域周期性破坏配对的先例，研究者提出GGY不参与配对、NN负责靶标识别的假设，并通过生信搜索、体外结合与体内GFP沉默实验证实了“1-nt跳跃规则”。该识别不需要PAM，可靶向双链任意一条链，特异性完全可通过改变NN重新编程。天然靶标预测与功能实验揭示VIPR系统参与噬菌体间冲突，既能抵御入侵噬菌体，也能迫使溶源噬菌体进入裂解。VIPR系统可分为七个类型，其中III型和V型富集于宿主染色体防御岛、靶向病毒序列且编码预测核酸酶，提示其已从病毒间竞争被宿主劫持改造为抗噬菌体免疫；研究者据此提出，现代CRISPR系统的直接祖先可能经历了类似轨迹。

而在第二项工作中，为阐明VIPR如何实现非连续RNA引导DNA识别，研究人员解析了21个VIPR核糖核蛋白复合物的冷冻电镜结构，涵盖二元、部分接合中间态和完全接合三元状态。二元结构显示，Vipr蛋白沿vrRNA寡聚化形成右手螺旋丝，每个重复单元结合一个原体，螺旋具六亚基周期性和约72 Å螺距。Vipr采用与CRISPR RAMP相同的RNA结合模式，相邻两个原体协同将GGY三碱基逐出配对，将NN定位以进行带缺口的靶标配对，使特异性完全由可编程的NN决定，且该机制在SUSP1与P. fulva系统中高度保守。三元结构显示，DNA结合后丝收缩，周期由六亚基变为五亚基，螺距减至约66 Å。拇指结构域周期性打断向导-靶标双链，在向导上逐出全部GGY，在靶标上仅逐出跳跃碱基x3，实现NN配对；向导Y3与靶标x3朝向相反，类似Class 1 CRISPR中的反平行碱基翻转。此外，非靶标链穿过双链形成“几何R-loop三链体”，三条链共享约66 Å螺距，但RNA每圈约25个核苷酸、DNA链各约15个，形成不对称几何；该结构由Vipr蛋白两端钳制非靶标链维持。三链体形成要求第三链为DNA。与完全配对双链DNA孵育捕获了5至11亚基的多种构象，揭示解旋与R-loop形成过程：RNA-dsDNA三链体始终位于前导边缘，R-loop三链体紧随其后，两者间仅靶标链位置变化，据此提出Vipr结合先构建三链体支架、随后局部靶标链移交逐步完成R-loop的模型。

总之，两篇工作通过结构引导的挖掘策略发现了噬菌体编码的VIPR系统——一种比CRISPR-Cas更古老的祖先型RNA引导DNA识别系统，其vrRNA以交替GGY/NN基序和“1-nt跳跃规则”实现非连续配对，无需PAM即可靶向双链任意一条链；进而通过21个冷冻电镜结构阐明了Vipr蛋白沿vrRNA组装为螺旋丝、经几何R-loop三链体完成靶标链移交的分子机制。该发现不仅揭示了RNA引导DNA识别的一种全新编码逻辑，为CRISPR-Cas起源于病毒间军备竞争提供了直接证据，也提示了从病毒防御系统向宿主适应性免疫演化的路径，并为开发新型可编程基因调控工具提供了潜在原型。

science.org/doi/10.1126/science.aei0498

science.org/doi/10.1126/science.aei3472

制版人： 十一

参考文献

1. E. V. Koonin, K. S. Makarova, Philos. Trans. R. Soc. Lond. BBiol. Sci.374, 20180087 (2019).

2. E. R. R. Moody et al.,Nat. Ecol. Evol.8, 1654–1666 (2024).

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