Sci Adv丨包暄文/方维佳/韦玮绘制肝内胆管癌三级淋巴结构时空图谱，揭示免疫生态位重塑与临床结局关联

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）是常见的原发性肝脏恶性肿瘤，具有侵袭性强、分子异质性高和总体预后不佳等特点。近年来，免疫检查点抑制剂和分子靶向药物为部分患者带来了新的治疗机会，但真正能够持续获益的患者仍然有限。如何更准确地识别具有抗肿瘤免疫潜力的患者，并找到能够重塑免疫微环境的干预靶点，是iCCA精准治疗面临的重要问题。

三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）是在慢性炎症、感染或肿瘤等情况下形成于非淋巴器官中的局部淋巴样结构，能够为抗原提呈、T细胞活化以及B细胞应答提供组织基础。越来越多的研究提示，TLS与肿瘤患者的生存和免疫治疗反应相关。然而，TLS并不是简单的“有或无”：同一肿瘤中的TLS可以处于不同位置、呈现不同成熟程度，并具有截然不同的细胞组成和功能状态。对于iCCA而言，TLS的空间结构如何影响临床结局、其内部免疫与基质细胞如何协同，以及TLS是否存在连续的状态演变，此前仍缺乏系统解析。

近日，浙江大学医学院附属第一医院方维佳、包暄文团队联合中山大学肿瘤防治中心韦玮团队在Science Advances期刊发表题为 Spatiotemporal Mapping of Tertiary Lymphoid Structure Heterogeneity Shapes Immune Niches and Clinical Outcomes in Intrahepatic Cholangiocarcinoma 的研究论文。研究整合组织病理学、蛋白质组学、成像质谱流式、单细胞空间转录组学和单核RNA测序等技术，构建了iCCA中TLS的多尺度时空图谱。研究表明，决定TLS临床意义的并非其是否存在，而是其所处位置、空间组织方式以及动态变化的免疫—基质生态。

研究团队首先在iCCA患者组成的发现队列中，对TLS的位置和形态进行了系统评估。根据组织学及CD20、CD3、CD21、BCL6和Ki67等标志物，TLS被划分为淋巴细胞聚集体（Agg）、初级滤泡（FL1）和具有生发中心的次级滤泡（FL2）三种形态。空间分析发现，仅22.2%的TLS位于肿瘤内部，其余主要分布在瘤周间质，并明显偏好位于肿瘤边界5毫米以内。以患者为单位，28%的患者可检测到瘤内TLS（intratumoral TLS，iTLS），77%的患者可检测到瘤周TLS（peritumoral TLS，pTLS）。基于TLS的位置和形态，研究者进一步将肿瘤微环境分为四类：存在iTLS的结构型（Structured）、无iTLS但存在成熟pTLS的排斥型（Excluded）、仅有未成熟pTLS的未成熟型（Immature），以及完全缺乏TLS的荒漠型（Desertic）。四类患者的总体生存期和无进展生存期存在显著差异，其中结构型患者的结局最好。多因素Cox分析显示，iTLS的存在与更好的总体生存和无进展生存独立相关。这说明，相比笼统地记录“TLS阳性”，将TLS放回肿瘤空间中进行判断具有更直接的临床价值。

随后，研究团队比较了不同TLS亚型的蛋白质组学特征。结构型肿瘤富集CR2、CD19、MS4A1和CXCL13等淋巴细胞相关分子，并表现出CD28共刺激、IL-12反应以及B细胞和T细胞活化等免疫程序；荒漠型肿瘤则更多呈现缺氧、上皮—间质转化、凝血、代谢重编程和细胞外基质重塑等特征。研究者进一步建立了预测iTLS状态的随机森林模型。MS4A1、CR2、TCL1A、BANK1、ADRA2A和CXCL13等是区分iTLS阳性与阴性肿瘤的重要特征。这一结果为将TLS相关空间信息转化为可量化的分子分层工具提供了依据。

为了观察TLS周围细胞如何在组织中排列，研究者进一步利用空间蛋白组在单细胞尺度解析免疫空间结构。结果显示，iTLS阳性的结构型肿瘤中，T细胞与B细胞形成致密而有序的TLS核心；在其周围，M1组织驻留巨噬细胞（M1-like RTMs）、树突状细胞（DCs）和CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞彼此靠近，形成富含抗原提呈细胞的空间邻域（apc-CN）。这一邻域又与由有序T/B细胞聚集构成的TLS核心邻域（TLScore-CN）紧密相邻。相比之下，iTLS阴性肿瘤中的免疫细胞分布更为分散，细胞邻域之间的配对也更随机。空间距离、细胞互作和邻域界面分析共同支持这样一个组织模型：M1组织驻留巨噬细胞和DCs可能首先参与局部抗原提呈与CD4⁺ T细胞活化，随后促进淋巴细胞募集和有序聚集，最终形成成熟的TLS结构。因此，功能性TLS更像是多个免疫单元按照特定空间关系协作形成的“局部免疫器官”，而不只是淋巴细胞数量增加。

研究团队进一步使用单细胞空间转录组技术，在全组织尺度识别出61个TLS。研究者将每个TLS视为一个独立空间单元，从中解析出14类细胞生态位，并依据转录特征将TLS划分为聚集期（Aggregated）、激活期（Activated）和激活后期（Post-activated）三种拟时序状态。值得注意的是，这一分子分型与传统Agg、FL1和FL2形态学分级仅部分重叠，提示外观相似的TLS可能处于不同功能阶段。聚集期TLS富含iCAF、CCL19⁺ CD8⁺ T细胞、cDC2和CXCL12⁺巨噬细胞，并以血管生成和TGF-β信号为特征，呈现基质启动和免疫募集状态。进入激活期后，CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞、记忆B细胞、干扰素反应型CAF（ifnCAF）、mregDC和GZMK⁺ CD8⁺ T细胞相关生态位明显扩增，同时伴随干扰素反应、PD-1通路及TCR信号增强。激活后期则出现更多TCF7⁺ CD4⁺ T细胞、Treg以及生发中心样B细胞区域，并表现出炎症和调节性信号的重新整合。细胞通讯分析还发现，CXCL12信号的主要来源会随TLS状态变化：聚集期主要来自CXCL12⁺巨噬细胞和iCAF，激活期转由ifnCAF占据主导，激活后期则分散至多种细胞。单核RNA测序及空间映射进一步验证了这一过程：CXCL12⁺巨噬细胞和iCAF在早期TLS外围形成带状结构，随后ifnCAF及免疫细胞逐步向TLS内部重排。由此，研究提出了从“基质启动—免疫激活—调节性重塑”逐步演进的TLS成熟模型。

总的来说，该研究将TLS从一个静态的组织学指标推进为一个可分层、可追踪的动态空间生态系统：在临床层面，研究建立了基于位置和形态的四类肿瘤微环境，明确了iTLS的独立预后价值；在技术层面，构建并验证了基于蛋白质组学的iTLS分类器；在机制层面，揭示了M1组织驻留巨噬细胞、DCs、CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞、B细胞及不同CAF亚群在TLS形成和状态转换中的空间协作关系。这些发现为iCCA患者的免疫分层提供了新的框架，也提出了通过促进功能性TLS组装、调节巨噬细胞状态或重塑特定基质生态位来增强抗肿瘤免疫的潜在方向。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aeb7225

制版人： 十一

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