【JACS】酶反应：分支酸转化酶催化分子间碳-碳键的构建

导读

分支酸（Chorismate）是众多初级代谢产物和次级代谢产物的重要前体。因此，能够转化分支酸的酶是构建生物活性分子的有用生物催化剂，但目前已知的分支酸生化反应范围仍然有限。近日，美国犹他大学与Aaron W. Puri课题组鉴定出一种分支酸转化酶（TunB），该酶无需任何辅因子即可催化分支酸参与分子间的碳-碳键形成反应。TunB参与Tundrenone的生物合成，后者是一种由甲烷氧化细菌产生的天然产物，而根据氨基酸序列同源性分析，此前并未预测到TunB能以分支酸为底物。因此，TunB功能的发现揭示了一种出乎意料的分支酸转化酶，有望基于这一重要代谢物构建更多样的化合物骨架。相关研究成果发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.6c09780）。

背景及出发点

分支酸是一种重要的中心代谢物，是初级代谢与次级代谢之间的分支点。除芳香族氨基酸外，分支酸转化酶还参与多种生物活性分子的合成，包括免疫抑制剂雷帕霉素、抗肿瘤化合物C-1027、铁载体肠杆菌素以及辅酶叶酸。目前已知仅有六类分支酸转化酶能够从分支酸及其异构体异分支酸出发，合成这一系列重要的分子骨架，这表明该代谢节点可能还蕴藏着大量尚未发现的生化反应途径。值得注意的是，目前已知该类酶中仅有一种能够催化分子间碳-碳键的形成。在甲基萘醌生物合成的第一步中，MenD催化α-酮戊二酸以硫胺素依赖的Stetter型1,4-加成方式连接到异分支酸上（Figure 1A）。酶促碳-碳键形成对于获取治疗性化合物合成所需的复杂骨架至关重要。因此，鉴定更多能够形成碳-碳键的分支酸转化酶，对于在生物活性分子的大规模合成中拓展手性及芳香族结构单元的获取途径具有重要意义。天然产物生物合成途径是新生化反应的丰富来源。甲烷氧化菌（MOBs）是一类尚未被充分发掘的新型天然产物及其相关生化转化的来源。甲烷氧化菌Methylobacter tundripaludum21/22能够产生Tundrenone，其是一种高度氧化的天然产物，其西片段（1）含有一个与分支酸结构相似的四氢茚酮母核（Figure 1B）。

（Figure 1，图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

因此，tun生物合成基因簇（BGC）（Figure 2A）有可能编码新型分支酸转化酶，负责催化分支酸与另一种尚未明确的代谢物之间形成分子间碳-碳键。为探究tun生物合成基因簇中是否存在新型分支酸生化反应，作者首先构建了一个在大肠杆菌中合成冬孢菌酮的异源表达系统。该系统除了能够规避基因必需性带来的研究障碍外，还有利于快速进行遗传操作，并提高冬孢菌酮及化合物1的产量（Figure 2B）。利用该系统，作者构建了tun生物合成基因簇的单基因缺失突变体文库。通过LC-MS/MS，作者筛选了每个突变体中化合物1的产生情况。作为阳性对照，作者使用了一株先前已证实能够产生化合物1的冻土甲基杆菌（M. tundripaludum）突变株，即冻土甲基杆菌ΔtunJ。在该系统中，作者鉴定出三个对化合物1合成至关重要的基因：tunB、tunN和tunO（Figure 2C）。仅敲除tunB可完全消除化合物1的产生，而ΔtunN和ΔtunO突变株在缺失筛选中，作者发现除TunB外同时表达TunN和TunO可使化合物1的产量提升50倍。

图文解析

（Figure 2，图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接下来，作者旨在鉴定通过异源表达生成化合物1所需的最小基因集。仅异源表达TunB就足以在大肠杆菌（E. coli）中产生化合物1，而在缺失TunB的情况下表达TunN和TunO则无法产生（Figure 3A）。与缺失筛选结果一致，作者发现，除TunB外同时表达TunN和TunO可使化合物1的产量提高50倍。为探究TunB与TunN、TunO的功能关联，作者测定了在加入与不加入TunN、TunO的条件下，TunB催化生成化合物1的量随时间的变化规律。出乎意料的是，TunN与TunO既不改变反应速率，也不提高反应的最终产量（Figure 3B）。因此，仅TunB单酶就足以催化二羟丙酮磷酸（DHAP）与分支酸之间的碳-碳键形成反应。值得注意的是，不同于硫胺素依赖性的MenD酶催化α-酮戊二酸与异分支酸的加成反应，TunB催化该反应无需任何辅因子参与。

（Figure 3，图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

基于上述的研究，作者推测，在TunB反应机制的第一步中，另一个起催化作用的赖氨酸残基K256与DHAP形成Schiff碱（Figure 4A）。作者发现，TunB的K256A突变体可完全消除化合物1的产生，这与该氨基酸在催化中的重要作用一致。接下来，通过与不依赖Zn²⁺的PBGS酶及I型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶类似的机制，该Schiff碱中间体被去质子化，形成亲核性烯胺。该机制的后续步骤仍不甚明确。分子间碳-碳键的形成可能是通过对分支酸环己二烯环的C1-位或C2-位的亲核进攻实现的。从化学角度看，同样连接在C1-位的羧酸根的吸电子效应，支持反应按Mannich型机制对分支酸的C2-位进行亲核进攻（Figure 4B）。然而，化合物1的环戊烯酮环中α-羟基的位置表明，酶的催化微环境可能将进攻位点引导至C1-位（Figure 4C）。

对于上述推测的C2-位进攻途径，第二个碳-碳键的形成可能是通过另一次亲核取代反应（类SN1-或SN2-机制）进行的，磷酸基作为离去基团从DHAP衍生的Schiff碱中间体上脱离（Figure 4B）。此前在4-(羟甲基)-2-呋喃甲醛磷酸的化学酶促合成中，也曾提出GA3P衍生的希夫碱中间体存在类似的磷酸离去基团机制。而对于另一种推测的C1-位进攻途径，反应更可能以协同的类[3+2]环加成方式进行（Figure 4C）。随后，脱羧反应可形成化合物1的核心骨架（Figure 4B和Figure 4C）。最后，Schiff碱发生水解，释放出化合物1的还原形式（Figure 4B和Figure 4C）。由于分支酸和DHAP的氧化态所限，不借助氧化还原化学反应就不可能将这些底物转化为化合物1。从一级序列预测，TunB不利用任何氧化还原辅因子，且在不添加此类辅因子的条件下仍能生成化合物1，因此一种可能是：自发氧化事件促成了化合物1的形成（Figure 4D）。

（Figure 4，图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

美国犹他大学与Aaron W. Puri课题组证实了TunB是一种不依赖辅因子的分支酸转化酶，能够催化分子间碳-碳键的形成。TunB与已知的各类分支酸转化酶均不具有序列相似性，因此其活性无法仅通过基于同源性的基因组注释来预测。基于这些发现，通过基因组挖掘可以发现更多利用分支酸的生物合成途径。此外，本研究凸显了甲烷氧化菌（MOBs）等尚未被充分发掘的微生物作为新型生化转化来源的价值，这些新型反应有望用于生物催化法获取具有生物活性的化学骨架。

论文信息

Intermolecular Carbon−Carbon Bond Formation by a Chorismate-Converting Enzyme

Rachel C. Hurrell, Iqra Ilyas, Maddox B. Riewald, Florian Hubrich, Aaron W. Puri

J. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.6c09780

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