Nat Commun丨黄林/David Lilley团队揭示类HDV核酶金属离子路易斯酸催化机制

核酶（ribozyme）是一类能够催化化学反应的RNA分子，在生命起源的“RNA世界”假说中占据核心地位。在已知的自然核酶中，催化磷酰基转移反应的策略主要分为两类：一类是如I型内含子（Group I intron）等较大的核酶，依赖活性中心多个金属离子直接参与化学转化；另一类是数量更多的小型自切割核酶，通常利用核苷酸碱基作为广义酸或广义碱来驱动反应，金属离子主要承担结构支撑角色。

HDV核酶是一类广泛存在于病毒、真核生物和噬菌体中的小型自切割核酶，其活性中心也结合有二价金属离子。然而，该金属离子究竟是像其他小核酶那样通过水合水分子充当“广义碱”，还是直接参与催化充当“路易斯酸”，长期以来存在争议。由于此前缺乏高分辨率的切割前结构以及系统的生化验证，这一问题始终未能得到定论。

在深入探讨这类核酶的具体机制之前，有必要先厘清核酶催化中的两种核心化学策略：

（1）广义酸碱催化（General Acid-Base Catalysis）：这就像是一场精密的质子“交接接力”。在RNA切割反应中，广义碱负责夺走一个质子（H⁺），将进攻基团（2'-OH）“激活”为强大的亲核试剂；而广义酸则负责递出一个质子，中和并稳定即将断裂离开的5'-氧离去基团（5'-O⁻）。两者分工配合，一个负责“发起进攻”，一个负责“安抚离去”，协同促成反应。

（2）路易斯酸催化（Lewis Acid Catalysis）：路易斯酸是指能够接受电子对的物质。在RNA催化中，二价金属离子（如Mg²⁺）是典型的路易斯酸。不同于单纯的带正电“静电吸引”，它通过直接与反应底物（如磷酸骨架上的氧原子）形成配位，主动“分担”反应过渡态中积累的负电荷，并极化化学键以降低活化能，从而大幅加速反应进行。

近日，中山大学孙逸仙纪念医院黄林课题组与英国邓迪大学David M. J. Lilley团队合作，在Nature Communications发表题为Structure and mechanism of HDV ribozymes revealing Lewis acid catalysis by a metal ion的研究论文。该研究通过解析来自线虫和噬菌体的类HDV核酶高分辨率晶体结构，结合动力学与突变实验，有力揭示了HDV核酶采用“金属离子路易斯酸+保守胞嘧啶广义酸”的协同催化机制，为这一长期争议提供了关键实验证据。

研究团队首先从非病毒来源的类HDV核酶入手，分别选取了线虫Caenorhabditis briggsae和噬菌体Ackermannviridae来源的核酶进行体外重构。经典的J1/2连接区断开策略在这两类核酶上均无法获得有效活性。研究人员转而采用打开P4茎区的工程化改造策略，成功获得了具有高催化活性的核酶体系。其中，C. briggsae核酶表现出极高的催化活性，切割速率高达9.3 min⁻¹，相较于非催化反应加速约一百万倍，是目前已知催化效率最高的自切割核酶之一。Ackermannviridae核酶经类似改造后活性也恢复至4.2 min⁻¹，表明该催化框架在远缘类群中具有保守性。

利用X射线晶体学，研究团队解析了C. briggsae核酶切割前与切割后的高分辨率结构。整体折叠呈现经典的嵌套双假结（nested double-pseudoknot）拓扑。与病毒HDV核酶不同的是，该核酶在活性中心附近存在一个额外的P1.1螺旋，其中包含一个非经典的C:U碱基对。在切割前结构的活性中心，一个Mg²⁺离子被清晰地观察到直接与可切割磷酸基团的pro-R非桥氧原子进行内层配位，距离仅2.1 Å。而在切割后结构中，该金属离子消失，提示其在反应过程中经历了动态结合与释放。同时，结构显示活性中心保守的胞嘧啶C57的N3原子精确指向5'-氧离去基团，处于提供质子的理想几何位置。

为逐步解析催化机制，研究团队首先从广义酸角色入手。pH依赖性动力学实验拟合出的表观pKa为6.5，与质子化胞嘧啶的特征高度吻合。将C57突变为无法质子化的尿嘧啶（C57U）后，核酶活性完全丧失，直接证实了该胞嘧啶在反应中作为广义酸，为5'-氧离去基团提供质子的关键角色。

在阐明广义酸机制后，研究团队进一步追问金属离子的催化角色。此前主流观点认为，HDV核酶活性中心的金属离子可能通过其水合水分子充当广义碱来夺取2'-OH的质子。若该假说成立，反应速率应严格依赖于不同金属离子的水合pKa值。然而，金属离子置换实验显示，该核酶在Ca2+、Mg2+和Mn2+中的催化速率波动在2倍以内，与金属离子pKa之间不存在相关性，从而排除了“水合金属离子充当广义碱”的假说。

进一步的生化实验为金属离子的路易斯酸角色提供了关键证据。结构显示活性中心Mg2+直接与切割位点磷酸基团的pro-R非桥氧原子内层配位（距离2.1 Å）。结合病毒HDV核酶已有的立体特异性硫代磷酸效应，以及本工作中金属离子依赖与速率不依赖金属离子pKa等结果，支持Mg2+通过直接配位极化P–O键、增强磷原子亲电性，发挥路易斯酸催化作用。此外，针对活性中心附近G25位点的硫代突变（G25O⁶S）导致活性下降约1000倍，且无法被硫亲和性金属离子（Mn2+、Cd2+）挽救。结合结构分析，这表明Mg2+并非直接与G25配位，而是可能通过水分子网络与之相互作用，共同稳定活性中心。

综合以上结果，研究团队提出协同催化模型：直接配位的Mg2+作为路易斯酸激活亲核进攻并稳定过渡态，保守胞嘧啶C57作为广义酸为离去基团提供质子，二者协同完成磷酰基转移反应。

“金属离子路易斯酸+保守胞嘧啶广义酸”的协同催化机制示意图

这一发现的意义不仅限于HDV核酶本身。在RNA催化机制的演化谱系中，HDV核酶恰好填补了依赖核苷酸碱基广义酸碱催化的常规小核酶与依赖多金属离子构建活性中心的大型核酶之间的空白，构成了两者之间的“机制桥梁”。该研究为理解RNA催化机制的多样性与演化路径提供了关键实验依据，也为未来基于核酶的RNA工具开发提供了新的设计思路。

中山大学孙逸仙纪念医院罗宇航、陈小雪、林晓伟、廖文健与广州实验室肖博文为论文共同第一作者，中山大学孙逸仙纪念医院黄林研究员与英国邓迪大学David M. J. Lilley教授为共同通讯作者。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-77452-w

制版人： 十一

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