Cell Rep｜马军团队解析CCHFV聚合酶结构，揭示药物双位点抑制机制

克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）是一种高致病性病原体，可引起严重的克里米亚-刚果出血热。该病毒主要经蜱叮咬传播，也可通过接触感染者的血液或体液发生传播。感染后患者可出现高热、出血及多器官功能损伤等严重症状，病死率较高。鉴于其较强的致病性和传播风险，世界卫生组织（WHO）已将其列为需重点关注并亟需开展防控措施研发的病原体之一。然而，目前临床上尚无获批的特异性抗病毒药物。因此，深入研究CCHFV病毒复制机器的结构及作用机制，对于认识病毒复制过程、探索新的抗病毒干预策略具有重要意义。

近日，深圳湾实验室传染病研究所马军课题组在Cell Reports发表了题为Cryo-EM structures ofCCHFV polymerase reveal a stepwise initiation stabilization pathway and adual-site inhibition mechanism的研究论文。研究团队利用冷冻电镜单颗粒分析技术，解析了CCHFV RNA聚合酶（L蛋白）处于无配体、5′vRNA启动子结合状态、5′/3′vRNA双启动子复合物及抑制剂结合等关键状态下的高分辨率结构。通过对不同结构状态进行比较，研究揭示了CCHFV基因组启动子识别与聚合酶逐步稳定的结构机制，并解析了广谱抗病毒分子苏拉明（Suramin）的双位点抑制模式。

1 解析CCHFV聚合酶结构，揭示病毒RNA合成机器的基本架构

CCHFV L蛋白是病毒复制和转录过程中的核心酶，由3945个氨基酸组成，分子量约450 kDa，是目前已知最为复杂的病毒基因组复制机器之一。由于其分子尺寸巨大且具有较高的构象柔性，L蛋白的表达、纯化及高分辨率结构解析均具有较大挑战。研究团队采用哺乳动物细胞表达体系成功获得全长CCHFV L蛋白，并建立了稳定的体外RNA聚合酶活性检测体系。在此基础上，进一步开展冷冻电镜结构解析，获得了多个功能状态下、多构象的高分辨率结构。结构分析表明，尽管CCHFV L蛋白具有独特而庞大的辅助区域，其核心聚合酶区域仍保留了布尼亚病毒目RNA依赖性RNA聚合酶高度保守的整体架构及关键催化元件。这些结构为进一步理解CCHFV聚合酶如何识别病毒RNA、招募模板并完成RNA合成提供了重要的结构基础。

2 揭示CCHFV聚合酶启动机制，阐明启动子识别与逐步稳定过程

病毒RNA聚合酶如何准确识别基因组两端的启动子，并将这一识别事件转化为适于RNA合成的结构状态，是理解CCHFV复制机制的关键问题之一。结构分析显示，CCHFV聚合酶在启动子结合后并不会立即进入完全稳定的状态，而是经历了由动态状态、预激活状态向稳定预起始复合物逐步转变的构象成熟过程。在无RNA结合的状态下，L蛋白的部分功能区域具有较高的构象柔性。当5′ vRNA启动子的特征性“钩状”（hook）结构结合至聚合酶后，vRNA-binding loop（vRBL）、Fingers和Arch等多个区域逐渐变得有序，并形成更加有利于后续RNA招募的预激活构象。值得注意的是，此时聚合酶尚未形成完全稳定的预起始复合物。这些结构观察提示，5′端启动子识别可能构成CCHFV RNA合成启动过程中的第一道结构性调控步骤。

随着3′ vRNA模板进一步结合，聚合酶发生更加广泛的结构稳定和局部重排。3′ vRNA首先进入位于催化中心之外的次级结合位点，并通过与vRBL、Bridge等结构区域形成广泛相互作用，进一步稳定聚合酶整体构象。与此同时，部分此前具有较高柔性的区域逐渐有序化，最终形成更加紧凑和稳定的5′/3′双启动子预起始复合物。基于这些不同结构状态，研究团队提出了CCHFV聚合酶逐步启动的结构模型，即经历：无配体动态状态 → 5′启动子识别与预激活 → 3′模板招募 → 稳定的5′/3′双启动子预起始复合物。这一结果为理解CCHFV聚合酶如何协调识别病毒基因组两端的启动子，以及RNA合成启动过程如何受到多步骤结构调控提供了新的机制框架。

3 揭示苏拉明“双位点”协同抑制机制，为抗病毒药物设计提供新思路

在解析CCHFV聚合酶启动机制的基础上，研究团队进一步探讨了针对这一病毒复制机器的药物干预机制。体外酶活性实验表明，具有广谱抗病毒活性的分子“苏拉明（Suramin）”能够有效地抑制CCHFV L蛋白的RNA聚合酶活性。冷冻电镜结构显示，苏拉明并非通过单一结合位点发挥作用，而是在L蛋白上形成两个空间分离的结合位点，从不同层面干扰聚合酶功能。第一个位点（Site 1）位于5′ vRNA启动子结合区域。苏拉明带有多个负电荷基团，其整体电化学特征在一定程度上模拟RNA磷酸骨架。在该位点，苏拉明可占据5′ vRNA的结合区域，通过空间和电荷方面的竞争削弱 5′启动子与聚合酶之间的相互作用，从而干扰启动子识别及后续的聚合酶启动。第二个位点（Site 2）位于Linker–Fingers界面。在该位点，多个苏拉明分子形成特定的结合模式，并诱导周围区域发生局部结构稳定和构象重塑。由于Fingers区域的构象动态与RNA模板转运以及聚合酶催化循环密切相关，苏拉明对该区域的结合可能通过限制聚合酶关键区域所需的构象可塑性，对其RNA合成活性产生额外的变构抑制作用。

基于上述结构和功能结果，研究团队提出了“阻断启动子识别＋限制构象动态”的双位点抑制模式：苏拉明一方面通过竞争性占据5′ vRNA结合区域，干扰病毒启动子识别；另一方面通过结合Linker–Fingers界面并限制区域的构象可塑性，对聚合酶功能产生额外的变构抑制作用。这一发现为理解苏拉明抑制CCHFV聚合酶的分子机制提供了新的结构依据，也提示除了传统的催化中心和RNA结合口袋外，参与聚合酶构象调控的远端界面同样可能成为抗病毒小分子药物设计的潜在靶点。

总结与展望

近期，多项冷冻电镜研究相继解析了CCHFV聚合酶在不同功能状态下的结构，并从启动子识别、RNA延伸以及核苷类似物和内切酶抑制剂的作用机制等多个方面，逐步建立了对这一超大分子RNA复制机器的结构与机制认识。

本研究在解析CCHFV聚合酶多个功能状态结构的基础上，通过结构比较将不同状态下的结构信息串联起来，提出了CCHFV RNA合成启动过程中由动态状态、预激活到稳定预起始状态的逐步构象成熟模型。与此同时，研究进一步将聚合酶的构象动态与药物抑制联系起来。苏拉明不仅能够竞争性干扰5′ vRNA启动子识别，还可通过结合远端Linker–Fingers界面限制关键区域的构象变化，提示聚合酶正常功能所依赖的构象动态平衡本身也可以成为小分子干预的靶点。

总体而言，本研究从“聚合酶如何被逐步启动”和“聚合酶如何被远端抑制”两个层面拓展了CCHFV聚合酶的结构机制研究：前者揭示了RNA启动过程中的逐步构象成熟，后者则展示了针对聚合酶构象动态进行干预的可能性。两方面发现相互呼应，为进一步理解CCHFV RNA复制机器的动态调控机制，以及开展新型抗病毒抑制剂的理性设计和结构优化提供了新的研究思路。

深圳湾实验室传染病研究所助理研究员杨侃侃、客座研究生吴海强和刘勋碧为共同第一作者，特聘研究员马军为本文通讯作者。冷冻电镜数据在深圳医学科学院（SMART）结构生物学实验平台采集，生物层干涉实验在SMART生物技术中心样品制备与分析平台完成。

原文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(26)01023-5

制版人：十一

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