Science丨周海霞博士等解析人呼吸道纤毛过渡区原位结构，鉴定两个原发性纤毛运动障碍致病新基因

纤毛（ cilia ）是细胞表面伸出的毛发状细胞器。在人的呼吸道 中 ， 运动纤毛 以协同一致的节律摆动，把黏液、颗粒物和病原体不断向外推送 —— 这一过程被称为 黏液纤毛清除（ mucociliary clearance ） ，是 呼吸道 最重要的天然屏障之一。当这套机器出问题时，就会引发 原发性纤毛运动障碍（ primary ciliary dyskinesia,PCD） 。这是一种常染色体隐性遗传的运动纤毛病，患者反复出现鼻窦炎、中耳炎、支气管扩张，约半数伴有内脏位置异常，部分还存在生育障碍。 在目前已知的 50 余个 PCD 致病基 因 中 ，绝大多数编码轴丝（ axoneme ）相关组分。然而，仍有 20%–30% 的 PCD 患者无法获得分子诊断 ，提示还存在尚未被认识的致病机制。

位于纤毛基部的 过渡区（ transition zone,TZ） ，是连接基体 (basal body) 三联微管（ TMT ）与轴丝双联微管（ DMT ）的特化区段，长期被视为控制纤毛蛋白组组成的 “ 分子闸门 ” 。以往的遗传学证据显示， TZ 相关基因的突变会导致以 初级 纤毛（ 非运动 纤毛） 为主的纤毛病，如 Joubert 综合征、 Meckel-Gruber 综合征、肾 痨 等；而在 PCD 中却 几乎 没有 TZ 基因的报道。这一 “ 空白 ” 曾被解读为： TZ 的门 控功能 对运动纤毛或许并非必需。与此同时， TZ 双联微管 的分子组成， 以及在哺乳动物中 才有的 连接相邻双联微管的 “TZ 连接体 ” （ TZ linker ） 究竟由哪些蛋白构成，一直是未解之谜。

2026 年 9 月 11 日，哈佛医学院 Alan Brown 团队与明斯特大学儿童医院 Heymut Omran 团队合作，在 Science 杂志发表了题为 In situ structure of the human ciliary transition zone links linker defects to primary ciliary dyskinesia 的研究论文。该研究利用原位冷冻电子断层扫描（ in situ cryo-ET ）结合 亚 断层平均，首次在人呼吸道多纤毛细胞中解析了过渡区双联微管和TZ linker的亚纳米分辨率结构，鉴定出九个组成蛋白，并证实ECT2L与DZANK1的双等位功能缺失突变可导致PCD——首次在遗传学层面把TZ的结构缺陷与人类运动纤毛病直接联系起来。

图 1. 从人到蛋白，再到疾病： 研究路线与主要发现 。

样 品 制备 、 数据 采集与处理 ：把冷冻电镜 “ 开 ” 到人的呼吸道上皮细胞里

要在接近生理的状态下看清纤毛基部，样品制备是第一道门槛。纤毛基部埋在细胞内部，既无法通过体外重构还原其真实环境，也难以用传统的 离体提纯 方法完整保留。

文章 第一 作者周海霞博士 为此建立了一套完整的原位制样 、 数据收集 与处理 流程：从健康供者鼻腔刷取上皮细胞，扩增基底细胞后在气液界面（ ALI ）分化培养，待充分分化形成多纤毛细胞 ， 再把细胞层分离为单细胞或小细胞团，滴加到电镜载网上快速冷冻固定；随后用聚焦离子束（ FIB ）在多纤毛细胞的边缘定点减薄，制备出厚度适合 cryo-ET 成像的薄片（ lamella ）。 然后在此基础上采集了几百套 tilt series 并完成 断层重构 。 得到的断层图显示 TZ 区段的双联微管显示出与轴丝双联微管明显不同的特征： 管腔内可见呈周期性横纹排列的微管内蛋白（ MIP ） ，管间则存在把一根 DMT 的 A 管与相邻 DMT 的 B 管连接起来的横向连接体 TZ linker 。再通过 亚断层平均，把 TZ 双联微管和 TZ linker 的结构推进到亚纳米分辨率。

原位 cryo-ET 是一项比较前沿的技术， 每一个环节都没有现成的答案 。作为哈佛医学院最早一批使用 cryo-FIB 的研究者，周海霞几乎是从零开始摸索 ： 让多纤毛细胞既保持纤毛完整、又以合适的厚度和分布冷冻在载网上，优化 了 FIB 减薄的条件、提高 了 出片成功率 ， 对 TZ 区 进行半手动采 样、 编写 基 于 napari 的 Python 工具进行颗粒筛选 来辅助 亚断层平均 从而 提高分辨率 。 这期间她还和哈佛医学院冷冻电镜平台共同组织了每月一次的 cryo-ET 用户会议。

结构与 AI 联手： 从头 鉴定 TZ 的组成蛋白

有了亚纳米分辨率的密度，下一步是回答 “ 这些密度分别是什么蛋白 ” 。 亚纳米分辨率虽然 可以 分辨二级结构，却看不清氨基酸侧链，传统方法无法据此判断一段密度究竟由哪个基因编码 —— 这正是原位结构生物学长期以来的 瓶颈 。

科学家 认为既然亚纳米分辨率可以看到二级结构，为什么不用这些信息来试着从头鉴定蛋白？于是使用刚发表 不久 的 DomainSeeker ， 结合结构与计算：首先构建了 AlphaFold2 预测的人类蛋白结构域文库，然后把实验得到的密度图进行分割，再进行逐一匹配、打分并排序。据此鉴定出了位于 TZ B 管 的 CEP41 和 ENKD1 ，沿 A 管 和 B 管 成串排列 形成 TZ 特殊 横纹 的微管内蛋白 CAPSL ，以及 TZ linker 的主要组成成分： ECT2L 与 SKP1 形成 的 2:2 异源四聚 体。

但 TZ linker 密度中仍有一部分无法用该方法鉴定，而 未 鉴定 出 的蛋白应该和 ECT2L 相互作用 。于是， 周海霞用 AlphaFold2-Multimer 把 ECT2L 与两千多个人类纤毛蛋白逐一配对预测，并以机器学习打分方法（ cSPOC ）排序， DZANK1 在候选中脱颖而出； AlphaFold3 的 PAE 分析进一步提示 DZANK1 的锌结合（ ZnB ） 结构域与 ECT2L 的 F-box 之间存在高置信度 相互作用 界面。免疫共沉淀实验证实 了 二者 的 相互作用，并同时拉下了内源的 SKP1 与 DYNLL1 。结构上， DZANK1 的 ZnB 结构域桥接相邻的 ECT2L–SKP1 四 聚体，其 TQT motif 则与 DYNLL1 形成复合物， 通过微管结合结构域（ DMTB ） 锚定在 A 管界面。 TZ linker 的核心组分被确定为 ECT2L 、 SKP1 、 DZANK1 与 DYNLL1 四 者。随后， 超分辨免疫荧光与超微扩展显微成像（ U- ExM ）进一步证实 了这些蛋白 确实 存在 于运动纤毛的过渡区。

图 2. 超微扩展显微成像（ U- ExM ）显示 DZANK1 定位于过渡区。

从结构到疾病 及其机制 ：两个 PCD 新致病基因

结构 解析出 了 T Z linker 的组 成 蛋白 ，那么 这些蛋白 的缺失会不会致病？于是 Alan Brown 教授联系了明斯特儿童医院的 Heymut Omran 教授开展合作，对未获得分子诊断的 PCD 患者进行了遗传学筛查。研究发现了 ECT2L 的多个双等位功能缺失 突变 ，以及 DZANK1 的双等位功能缺失 突变 。患者呼吸道多纤毛细胞的免疫荧光显示，相应蛋白信号缺失。临床上，这些患者表现出典型的 PCD 特征：鼻窦浑浊或含气减少伴黏膜肿胀，胸部 CT 可见支气管壁增厚与支气管扩张。

图 3. 患者的鼻窦影像学表现。 自左至右：健康对照、 ECT2L 突变个体 OP-198 II1 与 OP-2226 II1 、 DZANK1 突变个体 OP-3278 II1 。星号标示上颌窦浑浊或含气减少伴黏膜肿胀，是黏液纤毛清除受损的典型影像特征 。

在患者来源的 ALI 培养中，透射电镜显示过渡区双联微管排列紊乱、 TZ linker 密度缺失，轴丝的 9+2 结构也出现不同程度的失序；扫描电镜则观察到明显的球状纤毛顶端（ bulbous tips ）。研究者 随后还利用 基因编辑（ CRISPR ） 对正常基 底 细胞进行了 ECT2L 的敲除，其 ALI 分化的多纤毛细胞 重现了患者中观察到的球状纤毛顶端表型 。 病人细胞的纤毛虽然摆动频率正常，但模拟黏液纤毛清除功能的实验显示其几乎推不动任何东西。这提示 TZ linker 的作用可能在于维持纤毛的结构完整性与群体协同，从而保证有效的定向输运。

图 4. 患者纤毛的轴丝超微结构异常。 透射电镜横截面。左：低倍视野。右：高倍图，红色箭头指示外周双联微管缺失或排列紊乱等缺陷

总结与展望

总的来说，该研究在接近天然状态的人呼吸道细胞中解析了纤毛过渡区的原位结构，鉴定出九个组成蛋白，阐明了TZlinker由ECT2L–SKP1与DZANK1–DYNLL1协同构筑的分子架构，并证明其中两个基因的功能缺失突变可导致原发性纤毛运动障碍。

这一发现有三重意义：其一，它打破了 “TZ 门控对运动纤毛可有可无 ” 的既有认识，把过渡区正式纳入运动纤毛病的致病谱；其二，它为 20%–30% 尚无分子诊断的 PCD 患者提供了新的候选基因，有望提升临床诊断率；其三，它示范了原位结构生物学与 AI 结构预测相结合、由结构直接通向疾病机制的研究范式。研究者推测， TZ 作为纤毛的分子闸门， TZ linker 的破坏可能使本应被排除的蛋白进入纤毛、或使本应进入的蛋白被拒之门外，从而扰乱纤毛蛋白质组的组成 —— 这一机制有待后续工作检验。

哈佛医学院 周海霞 博士 与明斯特大学 Lea Terbeck 为该论文的共同第一作者。其中，论文的全部结构生物学工作 —— 包括细胞的培养与分化， cryo-FIB 薄片制备、数据采集、亚断层平均、 de novo 蛋白鉴定与原子模型搭建 —— 均由周海霞完成； TZ linker 组分蛋白的生化验证和前期细胞学验证亦由其完成，她同时与波士顿大学 Finn Hawkins 团队合作构建了 ECT2L 敲除的 呼吸 道类器官培养体系。明斯特大学儿童医院 Heymut Omran 团队主导了患者的遗传学分析、细胞学鉴定与表型分析以及临床评估。 日 内瓦大学的 Paul Guichard 和 Virginie Hamel 研究组进行了超微扩展显微成像研究。

原文链接：10.1126/science.aei5957

制版人： 十一

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