Nature | 华东师大叶海峰团队创建葡萄糖响应益生菌实现血糖智能调控

华东师范大学生命科学学院叶海峰教授团队在《自然》（Nature）杂志在线发表题为“Glucose-responsive probiotics for glycaemic modulation in mice and monkeys”的研究论文。该研究基于合成生物学理念，在益生菌大肠杆菌Nissle 1917中构建了葡萄糖感应基因线路，创建了一款名为GIFT的口服活体药物。该活体药物能够根据肠道中葡萄糖浓度的变化，自动调节治疗蛋白GLP-1的表达和分泌，并在糖尿病小鼠和非人灵长类模型中实现了安全、长效、精准的血糖控制。

研究团队设计了一套基于转录调控蛋白HexR的葡萄糖感应系统。当环境中缺乏葡萄糖时，HexR蛋白会结合到人工启动子区域，抑制下游基因的表达，葡萄糖分子存在时，细菌通过Entner-Doudoroff代谢途径将葡萄糖转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG），KDPG能够与HexR结合并使其从启动子区域解离，基因转录随即启动。研究团队系统地优化了启动子强度、HexR蛋白表达水平和核糖体结合位点的效率，最终得到的GIFT系统在20 mM葡萄糖诱导下实现了48.8倍的荧光报告基因表达激活，系统对葡萄糖的响应阈值约为5 mM，在10 mM以上浓度出现陡峭的激活曲线，这一响应特征与临床糖尿病诊断阈值（11.1 mM）高度吻合。GIFT对其他碳源分子（如乳酸盐、丙酮酸、甘油、果糖）的响应强度显著低于同等条件下的葡萄糖，表明该系统具有良好的葡萄糖特异性。

GIFT系统的可逆性和动态响应能力在体内实验中得到了验证。研究团队构建了表达细菌荧光素酶报告基因的GIFTlux菌株，将GIFTlux灌胃给予野生型小鼠后，小鼠在正常血糖条件下几乎检测不到生物发光信号，说明系统在无高血糖刺激时保持沉默状态。研究团队通过腹腔注射葡萄糖模拟血糖波动，在注射葡萄糖后30分钟内可检测到荧光素酶表达的显著上升，血糖水平回落至基线后发光信号也随之下降，第二次葡萄糖注射能够再次激活基因表达，这种“开-关-开”和“关-开-关”的表达切换模式证明了GIFT能够实时追踪体内血糖水平的变化。在自发的2型糖尿病模型db/db小鼠中，灌胃给予GIFTlux后3小时可检测到明显的生物发光信号，信号强度在12小时内逐渐消退，而野生型小鼠中未检测到明显信号，肠道内容物葡萄糖浓度测定显示db/db小鼠肠道葡萄糖浓度约为15 mM，该浓度足以有效激活GIFT系统。

研究团队进一步构建了表达人源GLP-1的GIFTGLP-1菌株。体外实验表明，GIFTGLP-1在15 mM葡萄糖诱导下以时间依赖的方式分泌有生物活性的GLP-1，分泌过程依赖SecA蛋白分泌通路。单次灌胃GIFTGLP-1（10^9 CFU）给db/db小鼠后，血清GLP-1水平在2小时内显著升高，伴随血糖水平下降，效果持续约12小时，这一时限与GIFT细菌在肠道中的停留时间一致。对db/db小鼠进行为期30天的每日一次灌胃治疗，GIFTGLP-1治疗组的空腹血糖从初始约25 mM下降至约15 mM，糖化血红蛋白水平显著降低，葡萄糖耐量和胰岛素耐量测试均显示明显改善，肝脏糖原含量增加，附睾脂肪系数下降。GIFTGLP-1治疗还改善了db/db小鼠的血脂谱，血清甘油三酯和总胆固醇水平显著降低，通过间接能量代谢测定发现治疗组小鼠的耗氧量和二氧化碳产生量显著增加，呼吸交换率降低，表明机体能量底物利用从碳水化合物向脂肪酸氧化转变，全身能量消耗增加。在糖尿病并发症方面，GIFTGLP-1治疗减轻了肝脏的脂肪沉积和炎症因子水平（IL-1β、TNF-α），降低了肝脏的氧化应激指标丙二醛并提高了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和总抗氧化能力，肾脏组织学分析显示肾小球病变减轻、胶原沉积和糖原蓄积减少，肾功能指标（血清肌酐、血尿素氮、尿蛋白）均得到改善，结肠组织的炎症因子水平和组织学损伤也明显减轻。16S rRNA测序显示GIFTGLP-1治疗组小鼠肠道中有益菌Faecalibacterium prausnitzii的相对丰度增加，潜在致病菌Enterococcus faecalis和Acetatifactor muris减少。

研究团队将GIFTGLP-1与临床用GLP-1受体激动剂司美格鲁肽在db/db小鼠中进行了头对头比较。单次给予GIFTGLP-1后小鼠血清GLP-1水平在40至250 pM之间波动，而司美格鲁肽注射后活性GLP-1水平达到6,000至12,000 pM。尽管GIFT产生的GLP-1绝对水平远低于司美格鲁肽，但在血糖控制效果上两者相当。在急性不良反应评估中，司美格鲁肽触发了血清免疫球蛋白E升高、降钙素水平上升、转氨酶短暂升高和促炎细胞因子释放，而GIFTGLP-1治疗组未出现这些改变。条件性味觉厌恶实验显示司美格鲁肽治疗组对蔗糖溶液的摄入量显著低于GIFTGLP-1治疗组和未治疗对照组，表明司美格鲁肽引起了较强的厌恶性副作用。在低血糖风险评估中，单用甘精胰岛素导致约20%的低血糖事件发生率，联合司美格鲁肽后低血糖事件显著增加，而GIFTGLP-1联合甘精胰岛素未增加低血糖风险。

研究团队在自发2型糖尿病食蟹猴中验证了GIFT的治疗效果。单次口服GIFTGLP-1（2×10^11 CFU/kg）后2小时血清GLP-1和血浆胰岛素水平迅速升高，血糖水平显著下降并持续长达3天。为期5周的隔日给药方案（每3天一次）有效恢复了糖尿病猴的血糖稳态，口服葡萄糖耐量测试曲线下面积显著降低，胰岛素抵抗指数得到改善，血脂谱出现轻微改善，治疗期间肝功能（ALT、AST、白蛋白/球蛋白比值）和肾功能（血尿素氮、肌酐）指标未出现异常变化，血常规检查未发现白细胞或免疫细胞亚群增加，体重保持稳定。

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