NAR | 钱书兵团队揭示蛋白质合成中肽键跳跃的分子机制

蛋白质合成并非总是一个线性过程。2A肽是一类18-22个氨基酸的短病毒元件，最早在口蹄疫病毒中被发现，能在核糖体翻译过程中介导一种特殊的”肽键跳跃”事件：在保守的PGP基序处（P-G↓P），不形成肽键而产生两个独立蛋白质。由于其模块化和高效性，2A肽已被广泛用于基因治疗、基因组工程和重组蛋白生产中实现单一开放阅读框多蛋白共表达。然而，尽管研究已有数十年历史，这种”跳跃”背后的分子机制仍不清楚。

近日，康奈尔大学钱书兵教授团队在Nucleic Acids Research发表题为Ribosome dynamics at the conserved PGP motif governs 2A peptide-bond-skipping efficiency的研究，结合定量2A报告系统与高分辨率核糖体印迹分析（Ribo-seq），系统解析了核糖体在2A核心序列处的动力学行为，提出核糖体在PGP基序终端脯氨酸密码子处的停留时间是决定跳跃效率的关键动力学节点。

研究者构建了双荧光报告系统（3×FLAG-miRFP—P2A—EGFP-3×HA），通过anti-Flag/anti-HA免疫印迹定量跳跃效率，并用Ribo-seq在密码子分辨率下检测核糖体在P2A区域的占据情况。研究发现核糖体在终端脯氨酸密码子的停顿是一个关键点。 插入猪特斯病毒2A（P2A）序列后，核糖体在PGP基序处出现明显富集峰，尤其集中在终端脯氨酸密码子（A位点）。上游插入柔性GSG接头可提升跳跃效率，同时降低核糖体停留时间，表明核糖体停留时间。

尽管多聚脯氨酸的肽键形成依赖eIF5A因子，但敲低eIF5A并未改变P2A跳跃效率或终端脯氨酸处的停留。同样，用小分子降解剂SRI-41315清除eRF1也未增加该位点的核糖体占据，提示这两个因子并非P2A跳跃的直接调控者。

有意思的是研究者在2A上游插入40个密码子的内源性氨基酸重复序列（经HiBiT间隔确保其已离开出口通道），发现很多氨基酸残基几乎无影响，但富含亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的疏水性重复序列强烈抑制P2A活性。这种抑制效应可以用延长线性接头序列长度的方法抵消。

该研究提出一个新的动力学模型：核糖体在PGP基序处的停留时间与肽键跳跃效率呈反比——停留越久，P位甘氨酸与A位脯氨酸之间形成肽键的概率越高，从而抑制跳跃。这与此前”停顿促进跳跃”的结构生物学观点看似矛盾，但作者提出的模型——适度停顿可能是跳跃发生的前提，但一旦停顿超过阈值（如受抑制性上游序列影响），动力学天平将重新偏向肽键形成而非跳跃。

更重要的是，研究揭示了核糖体出口通道之外的新生肽性质（尤其是疏水序列引发的共翻译质量控制或膜靶向/伴侣结合等相互作用）可以通过长程反馈调控肽基转移中心PTC内的催化事件，而非此前认为的仅通过改变PTC构象起作用。这一发现挑战了”上游柔性接头通过改变PTC构象促进跳跃”的现有模型，转而支持”新生肽柔性促进P位肽酰-tRNA水解，从而实现“stop-carry-on”的新机制。

该框架对基于2A肽的多基因表达载体设计具有直接指导意义——提示在设计融合蛋白时应避免在2A序列上游引入疏水性重复片段（如跨膜结构域衍生序列），并可通过插入柔性或刚性接头予以补偿。

文章共同第一作者武鑫成（Xincheng Wu）在康奈尔大学攻读博士期间完成了该项研究的主要实验工作，现已加入麻省总医院（MGH）/哈佛医学院（HMS），担任博士后研究员（Research Fellow）；另一位共同第一作者Saori Uematsu为钱书兵团队博士后研究员，负责了初期实验及测序数据分析。

https://academic.oup.com/nar/article/54/17/gkag875/8787807

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