民族药理学：舒肝补肾方通过调节杏仁核突触可塑性和神经炎症减轻腰椎间盘突出症相关的疼痛及情感障碍

【写在前面】：本期推荐的是由宁波市中医药医院、天津中医药大学第一教学医院等研究团队合作近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF6.8）的一篇文章，揭示舒肝补肾方通过调节杏仁核突触可塑性和神经炎症，减轻腰椎间盘突出症相关的疼痛及情感障碍。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Shugan Bushen decoction alleviates lumbar disc herniation-related pain and affective disturbances by modulating amygdala synaptic plasticity and neuroinflammation

研究背景：

腰椎间盘突出症（LDH）是腰背痛的主要病因之一，常表现为持续性神经病理性疼痛，并伴随焦虑、抑郁等情感障碍。全球范围内，腰背痛是导致残疾的主要原因之一，因其高患病率、易复发及与生活质量下降的关联，构成了重大的社会经济负担。越来越多的临床和实验证据表明，慢性疼痛不仅仅是外周结构异常的结果，更涉及中枢情感环路内的适应不良性改变。在疼痛相关情感环路中，杏仁核已成为整合伤害性输入与情感反应的关键枢纽，其环路内的异常活动与疼痛慢性化和情感失调密切相关。

谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）作为中枢神经系统主要的兴奋性和抑制性神经递质，在维持突触稳定性和调节神经元活动中发挥关键作用。Glu/GABA稳态的破坏已被证实与中枢敏化、异常神经元活动以及焦虑抑郁样行为相关。同时，神经免疫信号也参与突触失调——活化胶质细胞释放的促炎因子可影响神经递质动态，加剧慢性疼痛中的情感症状。

中医药在慢性腰背痛及其相关功能障碍的治疗中有着悠久应用历史。在中医辨证体系中，腰背痛常与肝肾失调相关，情绪因素被视为脏腑失调和症状持续的重要诱因。宋代陈无择所著《三因极一病证方论》中即已论述情志失调与脏腑不和可致慢性腰痛证候。舒肝补肾方（SGBS）正是基于“疏肝补肾”这一传统原则组方，由杜仲、当归、牛膝、黄芪、柴胡、何首乌、乌药、大黄、锁阳、砂仁、地龙、甘草等12味药材组成。现代临床报道已证实舒肝补肾类方剂在椎间盘源性腰背痛及LDH相关综合征中的应用，可改善疼痛程度和腰椎功能。然而，其在中枢神经层面的作用机制，尤其是在疼痛-情感整合脑区内对突触调节和神经免疫的调控作用，尚不清楚。

研究目的：

本研究旨在以自体髓核植入法建立的LDH大鼠模型为研究对象，系统评估SGBS对LDH诱导的疼痛敏感性和情感行为异常的治疗效果，并阐明其通过调节杏仁核神经免疫-突触重塑发挥镇痛和抗焦虑抑郁作用的中枢机制。

研究方法：

1. 药物制备与动物模型：按处方比例称取12味药材，以10倍量水浸泡30分钟，煎煮1小时过滤；药渣加8倍量水再煎煮1小时，合并滤液浓缩至目标浓度。采用雄性SD大鼠（6-8周龄），通过自体尾椎髓核植入L4-L5神经根建立LDH模型， sham组仅行手术暴露不放髓核。术后第1天开始灌胃给药，SGBS低剂量组（10.13 g/kg/天）、SGBS高剂量组（20.26 g/kg/天），连续14天。

2. 行为学评估：术后第7天和第14天评估疼痛敏感性和情感行为。采用Von Frey丝测机械痛阈、热辐射法测热痛阈；旷场实验（OFT）和高架十字迷宫（EPM）评估焦虑样行为；蔗糖偏好实验（SPT）评估快感缺失样行为。

3. 靶向神经递质代谢组学：术后14天采集大鼠脑脊液，采用LC-MS/MS靶向定量检测组胺、GABA、色氨酸、谷氨酰胺、5-羟吲哚乙酸、5-羟色胺、谷氨酸、组氨酸、犬尿氨酸、去甲肾上腺素和酪氨酸等11种神经递质及其代谢物。

4. 杏仁核转录组学：术后14天取杏仁核组织提取总RNA，进行Illumina平台双端测序，以|log2FC| ≥ 1且P < 0.05为阈值筛选差异表达基因，并进行GO和KEGG功能富集分析。

5. Western blot与免疫荧光：检测杏仁核组织中突触相关蛋白（mGluR1A、GRIN2B、VGAT、GRIA1、GAD1、PSD95、p-CaMKII、VGLUT1）、PI3K/AKT/CREB信号通路蛋白及炎症相关蛋白（IL-17A、NF-κB、Iba1、CD68）的表达。并行PSD95/GRIA1、p-CREB/GAD1、IL-17A/Iba1等双标免疫荧光染色。

6. 全细胞膜片钳记录：制备含基底外侧杏仁核（BLA）的急性冠状脑切片，在电流钳模式下记录BLA神经元自发动作电位频率和静息膜电位。

7. 网络药理学分析：基于SGBS中鉴定的50种化学成分，从TCMSP数据库检索候选靶点，与腰背痛和抑郁症相关基因取交集，构建蛋白-蛋白互作网络，进行GO和KEGG富集分析。

研究结果：

1. SGBS的化学轮廓：通过UPLC-Q-Exactive质谱从SGBS水提物中鉴定出50种化合物，按峰面积排序前十位包括：葛根素、大豆苷、小檗碱、芒柄花苷、香菇多糖、表儿茶素、芒柄花素、L-酪氨酸、胆碱和L-缬氨酸。

2. SGBS显著改善LDH大鼠疼痛敏感性与情感行为异常：LDH模型组大鼠术后第7、14天机械痛阈和热痛阈显著降低。SGBS高剂量组治疗14天后显著提高机械痛阈和热痛阈。OFT中模型组总运动距离和中央区停留时间显著减少；EPM中开臂进入次数和开臂停留时间显著减少；SPT中蔗糖偏好率显著下降。SGBS高剂量组显著改善上述所有情感行为指标。

3. SGBS调节脑脊液神经递质谱：LC-MS/MS靶向代谢组学显示，与sham组相比，模型组脑脊液中Glu和Kyn显著升高，GABA、Trp、5-HT和5-HIAA显著降低。SGBS治疗组GABA和5-HT显著升高，Glu和Kyn显著降低。PCA分析显示三组间显著分离，组内聚类良好。

4. 杏仁核转录组揭示突触相关通路富集：杏仁核转录组测序鉴定出模型组 vs sham组376个上调、170个下调差异表达基因；SGBS组 vs 模型组233个上调、390个下调差异表达基因。GO富集显示差异基因显著富集于神经元部分、突触、突触后和突触信号传导等神经元和突触相关功能类别。KEGG富集显示GABA能突触和谷氨酸能突触通路富集最为显著。

5. SGBS调节杏仁核Glu/GABA水平及突触标志物：LDH大鼠杏仁核Glu水平升高、GABA水平降低、Glu/GABA比值升高。SGBS高剂量组降低Glu、升高GABA、部分恢复Glu/GABA比值。Western blot显示LDH大鼠杏仁核谷氨酸能突触标志物（GRIN2B、GRIA1、PSD95、p-CaMKII、mGluR1A）显著上调，抑制性标志物GAD1显著下调。SGBS高剂量组逆转上述变化。双标免疫荧光显示LDH大鼠BLA区PSD95/GRIA1共定位增加，SGBS高剂量组显著降低这种共定位。

6. SGBS抑制LDH诱导的杏仁核神经元异常放电与激活：全细胞电流钳记录显示LDH模型组BLA神经元自发动作电位频率显著增加。SGBS高剂量组显著降低LDH诱导的自发放电频率增加。各组间静息膜电位无显著差异。免疫荧光显示LDH大鼠杏仁核c-Fos⁺/NeuN⁺双标神经元数量显著增加。SGBS高剂量组显著减少双标阳性神经元数量。

7. 网络药理学揭示PI3K-AKT、TNF和IL-17为候选通路：基于50种化学成分检索获得174个候选靶点，与腰背痛（5930个基因）和抑郁症（8792个基因）取交集得到137个重叠靶点。PPI网络筛选出52个核心靶点。KEGG富集分析显示PI3K-AKT、TNF和IL-17信号通路为显著富集的候选通路。

8. SGBS调控杏仁核PI3K/AKT/CREB相关信号：Western blot显示LDH大鼠杏仁核PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、CREB、p-CREB水平较sham组升高。SGBS高剂量组进一步上调这些蛋白水平。LDH大鼠VGLUT1升高、VGAT降低。SGBS高剂量组部分恢复VGLUT1和VGAT表达。免疫荧光显示SGBS高剂量组p-CREB/GAD1双标细胞显著增加。

9. SGBS抑制杏仁核IL-17A/NF-κB相关炎症反应与小胶质细胞活化：ELISA显示LDH大鼠血清和杏仁核中IL-17A水平显著升高。杏仁核IL-1β和TNF-α水平也显著升高。SGBS高剂量组显著降低上述炎症因子水平。Western blot显示LDH大鼠杏仁核IL-17A表达升高、p-NF-κB/NF-κB比值升高、CD68和Iba1表达升高。SGBS高剂量组抑制上述炎症和小胶质细胞活化相关蛋白的表达。双标免疫荧光显示LDH大鼠BLA区IL-17A荧光强度和Iba1阳性细胞数增加。SGBS高剂量组减弱这些变化。

研究结论：

本研究首次系统揭示了中药复方舒肝补肾方（SGBS）通过调控杏仁核神经免疫-突触重塑网络缓解腰椎间盘突出症相关疼痛及情感障碍的中枢机制。SGBS的治疗作用可归纳为三个层面：

神经递质层面：降低杏仁核Glu水平、升高GABA水平、恢复Glu/GABA比值平衡，纠正LDH诱导的兴奋-抑制失衡；

突触可塑性层面：下调谷氨酸能突触标志物（GRIN2B、GRIA1、PSD95、p-CaMKII、mGluR1A、VGLUT1），上调抑制性标志物（GAD1、VGAT），减少PSD95/GRIA1突触后共定位，并通过PI3K/AKT/CREB信号通路促进GAD1阳性抑制性神经元的CREB磷酸化；

神经炎症层面：抑制IL-17A/NF-κB信号轴，降低IL-1β、TNF-α等促炎因子水平，减轻小胶质细胞活化（Iba1、CD68下调）。

这三个层面的协同作用最终降低了BLA神经元的异常自发放电和整体神经元激活水平，从而同时缓解疼痛 hypersensitivity 和焦虑抑郁样情感障碍。该研究为中药复方治疗慢性疼痛及其情感共病提供了新的神经生物学依据，也为靶向杏仁核神经免疫-突触重塑的药物研发开辟了新方向。

图片

Graphical abstract

图1. SGBS中代表性成分的UPLC–Q-Exactive质谱分析。（A、B）分别在负离子和正离子电离模式下采集的总离子流图。（C）根据峰面积排序鉴定出的含量最高的十种化合物。

图2. SGBS对LDH大鼠行为学表现的影响。（A）实验时间线；（B）术后0～14天体质量变化；（C、D）术后机械痛觉异常及热痛觉过敏；（E）旷场实验（OFT）代表性运动轨迹；（F）OFT总运动距离；（G）OFT中央区运动距离；（H）OFT中央区停留时间；（I）高架十字迷宫（EPM）代表性运动轨迹；（J）EPM入臂总次数；（K）EPM开臂入臂比例；（L）EPM开臂停留时间比例；（M）蔗糖偏好实验（SPT）的蔗糖偏好率。

图3. SGBS对LDH大鼠脑脊液神经递质谱的影响。（A）PCA得分图，显示假手术组、模型组和SGBS-H（治疗）组间明显分离；（B）热图展示各组神经递质及代谢物的差异表达（红色上调，蓝色下调）；（C–H）脑脊液中Glu、GABA、Trp、Kyn、5-HT和5-HIAA浓度的定量分析。

图4. SGBS对LDH大鼠杏仁核转录组改变的影响。（A）PCA得分图，显示三组样本分布；（B）差异表达基因（DEGs）热图（红色上调，蓝色下调）；（C）DEGs数量柱状图；（D）Venn图展示重叠候选基因；（E）GO富集分析；（F）KEGG通路富集分析。

图6. SGBS减弱LDH诱导的杏仁核自发神经元放电与激活。（A）BLA神经元全细胞电流钳记录代表性迹线（假手术、模型、SGBS‑H组）；（B）自发动作电位（sAP）频率定量；（C）静息膜电位（RMP）定量。（D）杏仁核NeuN（绿）与c‑Fos（红）免疫荧光代表性图像（100×和1000×），白色虚线框示BLA与CeA；（E）c‑Fos⁺/NeuN⁺双阳性细胞定量。

图7. 网络药理学预测SGBS中可能介导腰背痛及其相关情感障碍治疗作用的潜在靶点。（A）SGBS、腰背痛和抑郁症共有潜在靶点的Venn分析；（B）PPI网络图；（C）关键靶点-成分-疾病网络；（D）GO富集分析；（E）KEGG通路富集分析。

图8. SGBS调节LDH大鼠杏仁核中与谷氨酸能/GABA能传递相关的PI3K/AKT/CREB信号及囊泡转运蛋白表达。（A）杏仁核组织中PI3K、p‑PI3K、AKT、p‑AKT、CREB和p‑CREB的蛋白免疫印迹代表性条带；（B–G）上述蛋白表达水平的定量分析；（H）VGLUT1和VGAT的蛋白免疫印迹代表性条带；（I、J）VGLUT1和VGAT表达水平的定量分析；（K）杏仁核/BLA区p‑CREB（绿）与GAD1（红）双标免疫荧光代表性图像（100×和800×）；（L）p‑CREB/GAD1双阳性细胞定量。

图9. SGBS减弱LDH大鼠杏仁核IL-17A/NF-κB相关炎症反应及小胶质细胞活化。（A、B）血清及杏仁核组织匀浆中IL‑17A的ELISA定量；（C、D）杏仁核IL‑1β和TNF‑α的ELISA定量；（E）杏仁核IL‑17A、NF‑κB、p‑NF‑κB、CD68和Iba1的蛋白免疫印迹代表性条带；（F–I）上述蛋白表达的定量分析；（J）BLA区Iba1（绿）与IL‑17A（红）双标免疫荧光代表性图像（100×和400×）；（K）IL‑17A荧光强度定量；（L）Iba1阳性细胞计数。

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