【JACS】中科院南海所闫岩/海南师大黎婉珊：Cytosporin生物合成中环氧介导的二氧化碳偶联生成五元环碳酸酯

导语

有机碳酸酯（OCs）是碳酸与醇形成的酯类化合物，在材料科学、合成化学和医药等领域具有广泛应用，将二氧化碳（CO₂）高效转化为有机碳酸酯的催化过程是可持续化学和能源研究中的关键目标。在现有策略中，将CO₂与环氧化物偶联生成环碳酸酯是实现CO₂利用最具技术可行性和应用前景的途径之一，尽管用于该转化的高性能催化剂的开发已取得显著进展，但仍存在一定局限性，包括对有机溶剂的依赖、使用过渡金属的催化体系，以及高能耗的反应条件（通常涉及高温和高压过程）。

近年来，越来越多结构新颖的有机碳酸酯类天然产物被成功分离鉴定，但是 其 生物合成 机制（尤其是真菌来源的五元环状碳酸酯）很大程度上 仍属未知 。 近日，中科院南海所闫岩海南师大黎婉珊合作， 鉴定并功能表征了 cytosporin E 组装的所有生物合成酶 ，阐明了其完整的生物合成路径。 并 证实 cytosporin E 中的五元环状碳酸酯结构单元， 是 在中性水 溶液 条件下 ， 通过非酶促的环氧介导的二氧化碳偶联反应形成。这种构建五元环状碳酸酯的策略在天然产物生物合成中尚属首次发现，或可为开发环境友好的有机碳酸酯合成路线提供 有价值 启示。

图文解析

如图1所示目前被发现的有机碳酸酯类天然产物结构形式多样，主要可以包括线性链型、小环（5–7元环）、中环（8元环）以及大环体系，其中五元环碳酸酯在天然产物中最为常见。例如，源自链霉菌的大环aldgamycin E和双环[7.3.0]十二碳二炔NCS Chrom A，植物来源的愈创木烷型倍半萜hololeucin和木脂素衍生物cycloolivil carbonate，以及由真菌产生的四氢蒽醌ocauxarthrol A和cytosporin E。同位素标记实验揭示细菌来源化合物aldgamycin E和NCS Chrom A中的五元环碳酸酯是通过无机碳酸氢盐的掺入形成。最近鉴定的四蛋白复合物通过氨甲酰基化、N-羟基化和非酶促酯化最终形成五元环碳酸酯。Cytosporins是一类真菌来源的meroterpenoids，以六氢苯并吡喃骨架为特征，具有血管紧张素II结合抑制和免疫抑制活性。其中cytosporin E是首个被发现含有五元环碳酸酯的成员。虽然多功能Baeyer-Villiger单加氧酶已被证明能催化真菌代谢物cytochalasin Z16中大环碳酸酯的形成，但在真菌天然产物中，五元环碳酸酯形成的机理和驱动力仍未得到阐明。

(图1. 来源：JACS)

如图2所示通过对产生菌Eutypella sp. F0219进行了基因组测序和分析。发现化合物1来源于高度还原型聚酮合酶产生的水杨醛前体，与trichoxide和flavoglaucin具有相似的生物合成逻辑。以HRPKS VirA为探针，鉴定了一个约46.8 kb的候选基因簇cyt，与vir和fog簇中编码的大多数蛋白具有较高的同源性。其中cyt簇包含15个基因：一个高度还原型聚酮合酶HRPKS（cytA）、四个短链脱氢酶SDR（cytB、cytD、cytK、cytL）、三个cupin结构域蛋白（cytC、cytG、cytH）、一个细胞色素P450氧化酶（cytE）、三个FAD依赖的单加氧酶（cytF、cytI、cytO）、两个转录因子（cytJ、cytM）和一个异戊烯基转移酶DMAT（cytN）。此外通过实验证实：CytC和CytG均为cytosporin生物合成中水杨醛前体3生成所必需。饲喂实验显示，仅表达cytE的A. nidulans能够将3转化为C6羟基化衍生物4。表达cytN使4在C4位异戊烯基化生成5。5饲喂表达cytF的菌株产生单一产物6，表明CytF催化5中C1-羟甲基的脱氢反应。然而，以6作为前体时，剩余cyt基因均不能将其转化为新代谢物，鉴于终产物1中C1以醇（而非醛）形式存在，推测6可能是生物途径中的旁支产物。

(图2来源：JACS)

如图3所示，化合物5饲喂表达cytH的菌株产生单一产物9。CytH属于cupin超家族，与催化环氧醌生物合成中连续反应的AtyE具有57.8%序列相似性：先氧化对苯二酚为醌，再不对称环氧化生成环氧醌。据此推测，CytH可以先将5氧化为醌中间体7，再催化C4–C5双键的环氧化生成环氧醌8，9则由8通过A. nidulans内源还原酶形成。

为避免A. nidulans内源背景修饰，后续实验改用Saccharomyces cerevisiaeRC01。5饲喂表达cytH的酵母产生单一产物8，8饲喂表达cytI的酵母产生9，证明CytI催化8中C6羰基的不对称氢化。表达cytO的酵母菌株可以将化合物9转化为10和11（相同分子量）。10在水溶液中室温下自发转化为11，且11在纯化过程中易水解为12。推测不稳定的化合物11可由10经过分子内重排形成，以缓解两个环氧基团所产生的环张力，随后水解生成较为稳定的产物12。化合物10饲喂表达cytK的酵母菌株产生单一产物2，因而推测CytK可以先催化10中C3羰基的不对称氢化生成13，随后由新生成的C3羟基对C17进行亲核进攻，引发环氧开环生成2。

(图3来源：JACS)

如图4所示在cyt簇所有后修饰酶功能表征完成后，化合物1中五元环碳酸酯形成的酶学机制仍然未知。由于cyt簇中无酶可负责碳酸酯环形成，从而考虑了自发非酶促反应的可能性。比较cyt簇生物合成酶学途径的终产物2与化合物1的结构，推测碳酸酯环可能源于无机碳酸氢盐。为了验证这个猜测，将2在pH 6.0–8.0的水溶液中与碳酸氢钠孵育6小时，结果呈pH依赖性：当pH≥7.0时，可以观察到化合物2向五元环碳酸酯1的显著转化；当pH>7.5时，化合物2的水解反应占主导，产物14为主要产物。这表明五元环碳酸酯可在中性水溶液条件下自发形成。

为阐明碳酸酯环形成机理，使用¹⁸O标记的碳酸氢盐探究1中氧原子的来源。当反应以¹⁸O标记碳酸氢盐进行时，产物1显示4 Da的分子量增加，从而提示化合物1中有两个¹⁸O原子被标记。¹³C NMR中¹⁸O诱导的同位素位移显示C5和C20均出现轻微高场位移，确认1中的O21和O22均来源于碳酸氢盐。相比之下，水解产物14的¹³C NMR仅显示C5的同位素位移，表明碱性条件下O21来源于溶剂水。

基于此，提出以下反应机理：在pH 7.0（碳酸氢根占主导）时，化合物2的C5环氧化物被碳酸氢根进攻，导致环氧开环生成碳酸酯中间体15，C6羟基对15中C20羰基的分子内进攻生成中间体16，脱水后生成五元环碳酸酯1。碱性条件下（氢氧根占主导），氢氧根对2中C5环氧化物的亲核进攻导致水解生成水解产物14。稳态假设下的动力学研究表明反应速率对底物2和碳酸氢根浓度呈一级依赖，室温下测得速率常数k≈0.15 M-¹·h-¹。

为了评估该自发CO₂偶联反应的普适性，测试了cytosporin类似物9、17–20的反应活性。单环衍生物9在pH 7.0无反应（碱性条件下发生环氧水解而非碳酸酯形成），而双环底物17–19和三环衍生物20均成功反应生成相应五元环碳酸酯。这表明除了环己烯环上的C4–C5环氧和C6-羟基外，稠合的四氢吡喃环对偶联反应也至关重要，其存在可能通过向环氧引入额外张力从而增加底物反应性。为探究C7脂肪族侧链的贡献，研究者将2臭氧化后用硼氢化钠或二甲硫醚还原分别得到31和32，两者在pH 7.0水溶液中均能形成相应碳酸酯产物，表明C7脂肪族侧链不影响CO₂偶联反应性。

(图4来源：JACS)

论文信息

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society杂志上（https://doi.org/10.1021/jacs.6c12612.），文章的第一作者是中科院南海所肖华助理研究员，文章的通讯作者是中科院南海所闫岩研究员和海南师范大学黎婉珊副教授。

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