Cell | 从头设计媲美甚至优于现有工具的荧光标签蛋白，实现从常规显微到超分辨、从哺乳动物到极端生命的荧光成像

荧 光成像是 现 代生命科 学 最重要的 研 究手段之一。 从绿 色 荧 光蛋白（ GFP ）到 HaloTag 等自 标记 蛋白 标签 ， 荧 光 标签 的 发 展使 研 究者能 够 在活 细 胞中直接 观 察蛋白 质 的定位、 运动 和相互作用， 并进 一步推 动 了超分辨成像和 单 分子成像等技 术 的 发 展 。 然而，目前广泛使用的 荧 光 标签 大多 来 源于天然蛋白， 并经过长 期蛋白 质 工程和定向 进 化 获 得。不同 标签 往往各有所 长 ，却很 难 同 时满 足理想 荧 光 标签 的多 项 要求。例如，荧光蛋白具有完全遗传编码的优势，但在亮度、光稳定性和光谱选择等方面受到自身发色团的限制；HaloTag和SNAP-tag可以利用性能优异的合成荧光染料，但蛋白尺寸较大，并且其共价标记模式在部分需要持续更新荧光信号的应用中受到限制。 除了上述在温和生理条件下的荧光成像应用， 嗜热生物则代表了荧光成像面临的另一类极端挑战 。现有天然蛋白来源的荧光标签往往难以在高温下保持稳定，因此长期缺乏能够在嗜热生物正常生长温度下工作的蛋白特异性荧光成像工具 。 因此，一 个 理想的 荧 光 标签 需要同 时 具 备 多 个 看似相互矛盾的性 质 ： 高亮度和光 稳 定性、兼容多种高性能荧光染料、可逆 结 合、 较 小的蛋白尺寸、 极 高的蛋白质 稳 定性，以及 与现 有 标签 正交 。 尽 管天然蛋白 经过数 十年的工程改造，目前仍缺少能 够 同 时 整合 这 些性 质 的 单 一 标签 。

与 此同 时 ，人工智能和 计 算蛋白 质设计 近年 来 取得了快速 发 展，使 研 究者 开 始能 够摆脱对 天然蛋白骨架的依 赖 ，直接 从头设计 （ de novo design ）具有特定 结构 和功能的新蛋白。不 过 多 数 工作也有局限： 首先，许多从头蛋白质设计工作需要计算生成大量候选序列，再通过实验筛选获得少数具有预期功能的蛋白 ；更重要的是， 对设计 成功 与 否的 评 价往往集中于是否 实现 了 预 期功能，而 与当 前广泛使用的生物 学 工具 进 行系 统 的性能比 较 仍然有限 。因此，一个极具挑战性的问题是： 能否在不依赖大规模筛选的情况下，从头设计出不仅“具有功能”，而且能够在实际荧光成像中媲美现有工具，并进一步突破其应用边界的蛋白质工具？

2026年9月1 日，加州大 学旧 金山分校（ UCSF ）William F. DeGrado和Bo Huang团队 合作， 在Cell发 表 题 为 De novo pan-rhodamine binders for fluorescence microscopy from mammalian cells to extremophiles 的 研 究 论 文。 研 究 团队从实际荧 光成像需求出 发 ， 从头设计 了一 类 泛 罗 丹明 结 合蛋 白 Rhobin （ Rhodamine Binder ） 。

1. 从应用需求反向定义蛋白质结 构

研 究 团队 在 设计开 始前就定 义 了六 项 希望同 时实现 的性能： 高亮度和光 稳 定性、兼容多 种罗 丹明染料、可逆 结 合、小尺寸、 极 高 热 稳 定性以及 与现 有 标签 的正交性 。 为了实现这一目标，他们将设计聚焦于罗 丹明（ rhodamine ）这一大 类 广泛 应 用于 现 代 荧 光成像的合成染料。不同 罗 丹明具有不同的 颜 色、亮度、光 稳 定性和 细 胞通透性，但共享相似的核心化 学结构 。 研 究 团队没 有 针对 某一 种 染料 设计 高度特 异 的 结 合蛋白，而是提出 了 pan-rhodamine binder 的 概 念：蛋白需要精准 识别 不同 罗 丹明共有的核心 结构 ，同 时 在 结 合口袋外 围 保留足 够 的空 间 和柔性， 从 而容 纳决 定不同染料光物理性 质 的化 学 取代基 。

为实现这 一目 标 ， 研 究人 员将 不同的功能需求直接 转 化 为 蛋白 质 的 结构设计约 束。例如，通 过识别罗 丹明 荧 光 态 共有的 羧 酸基 团 ， 设计 特 异 性相互作用以 稳 定其 发 光 状态 ；通 过 人 为构 建 “ 扩 大的 罗 丹明 ” 作 为设计 模板， 为 不同 罗 丹明衍生物的取代基 预 留 结 合空 间 ， 从 而 实现对 多 种罗 丹明 荧 光染料的兼容；同 时 ， 将 具有一定 结构 可塑性的配体 结 合 区 域 与紧 密堆 积 的 α 螺旋 结构 域相 结 合，在配体兼容性 与 蛋白 稳 定性之 间 取得平衡 。

在此基 础 上， 研 究人 员 利用 这 些 结构约 束指 导 RFdiffusion 生成蛋白骨架，通 过 LigandMPNN 设计氨 基酸序列， 并结 合 Rosetta 和 结构预测 方法 进 行 计 算 筛选 ，最 终获 得了一系列 从头设计 的 荧 光 标签 蛋白 Rhobin 。 Rhobin 仅 约 17 kDa ，大小 约为 HaloTag 的一半 。

2. 9个设计中8个获得纳摩尔级罗丹明结合

Rhobin 的 实验结 果 显 示出很高的 设计 成功率。 研 究 团队 最 终仅选择 了 9 个设计 序列 进 行 实验验证 ，其中 8 个 能 够结 合目 标 染料 JF660 ， 并 全部 达 到 纳 摩尔 级亲 和力 ；其中 Rhobin9 对 JF660 的 结 合 亲 和力 达 到 91 nM 。 更重要的是， Rhobin 并 非只 识别设计时 使用的 单 一染料。 Rhobin9 能 够结 合跨越不同波 长 和不同光物理性 质 的多 种罗 丹明，包括 Rh101 、 JF503 、 SiRhP 、 JF669 、 JF646 和 JFX646 等， 亲 和力普遍 达 到 纳 摩尔水平， 证 明了 “ 识别 共同核心、容忍外 围变 化 ” 的 pan-rhodamine 设计 策略。文章 进 一步通 过 晶体 结构验证 了 这 一 设计 ： 实验结构与计 算模型高度一致，配体也以接近 设计 的 构 象 结 合于口袋中 。

3. Rhobin在常规荧光显微成像中媲美现有成熟工具

对 于一 个 新的 荧 光 标签 而言， 纳 摩尔 级 的体外 结 合 并 不意味着 它 就是一 个真 正好用的 细 胞成像工具。因此， 研 究 团队进 一步 将 Rhobin 应 用于哺乳 动 物 细 胞， 并与 目前广泛使用的 HaloTag 以及其他可逆 荧 光 标签进 行了直接比 较 。 对 于 设计时 直接 靶 向 的 JF660 ， Rhobin9/JF660 在 细 胞中的 归 一化亮度 显 著高于 HaloTag7/Halo-JF660 以及可逆 HaloTag 体系 reHaloF/Halo-JF660 。 对 于具有 显 著 荧 光增强效 应 的 罗 丹明染料 JFX650 ， Rhobin2/JFX650 的 细 胞 归 一化亮度 与 reHaloF 体系相 当 ， 并 远 高于另一 种 天然染料 结 合蛋白 frFAST 。 这 些 结 果表明， 从头设计 的 Rhobin 不 仅 能 够 在体外 结 合染料，也能 够 在 真实细 胞 环 境中 达 到 与 成熟天然蛋白工具相 当 甚至更 优 的成像性能 。

Rhobin 的 应 用也 并 不局限于瞬 时转 染。 研 究 团队进 一步通 过 基因 组 整合 稳 定表 达 Rhobin ， 并将 其融合至一系列具有不同 亚细 胞定位的蛋白，在活 细 胞和固定 细 胞中均 获 得了高 质 量、低干 扰 的 荧 光成像，覆盖 细 胞核、核仁、 细 胞骨架、 内质网 、高尔基体、 线 粒体等多 种亚细 胞 结构 。 与 此同 时 ， Rhobin 还 可以 与 HaloTag 和 SNAP-tag 正交使用，在同一 细 胞中 实现 三色 荧 光成像， 为 其 与现 有成像工具的 组 合使用提供了基 础 。

4. Rhobin的可逆结合赋能超分辨和单分子成像

在常 规 活 细 胞和固定 细 胞成像中 验证 Rhobin 的 实 用性后， 研 究 团队进 一步 将 其推向 对 光 稳 定性和 单 分子性能要求更高的成像 场 景。 Rhobin 与 HaloTag 最重要的 区别 之一，是 Rhobin 对 染料采用可逆的非共价 结 合。 对 于 HaloTag 而言，一旦共价 连 接的染料 发 生光漂白， 该 蛋白分子的 荧 光信 号 也 随 之永久消失。而在 Rhobin 体系中，已 经 漂白的染料可以 从 蛋白中解离， 并 由溶液中新的 荧 光染料重新占据 结 合位点， 从 而不 断补 充可成像的 荧 光分子 。 研 究 团队 首先利用 这 一 “ 自我更新 ” 的特性 开 展了活 细 胞 STED 超分辨成像。 Rhobin 能 够清 晰分辨 宽 度低于 100 nm 的 内质网 管 状结构 ， 并 在 连续 STED 成像 过 程中 维 持 较 高的 荧 光信 号 ，使 研 究人 员 能 够长时间 追踪 内质网 的 动态变 化；相比之下， HaloTag 体系中 随 着染料持 续 光漂白，可用于成像的 荧 光分子 会 逐 渐 耗 尽 。除了超分辨成像，研究人员还进一步探索了Rhobin在单分子成像中的优势。通过降低染料浓度，Rhobin的可逆结合可以产生天然的单分子“闪烁”信号，从而实现单分子定位与轨迹追踪。更重要的是，新的染料能够持续替换漂白或解离的染料，不断补充可成像的单分子信号，从而显著延长有效成像时间。

5. 突破传统荧光标签限制实现75 ℃古菌活细胞成像

在常 规 、超分辨和 单 分子成像中， Rhobin 已 经 展 现 出 与现 有成熟 标签 相 当 甚至更 优 的性能。 研 究 团队进 一步提出了一 个 更具挑 战 性的 问题 ：从头设计能否突破天然蛋白工具本身的性能边界，实现现有工具难以完成的生物成像？

从头设计 蛋白的一 个 重要 优势 是可以 获 得 极 高的 结构 稳 定性。 Rhobin 的熔解 温 度超 过 95 ℃ ， 这 使 研 究 团队将 其 进 一步 应 用于 传统荧 光 标签难 以 进 入的 场 景 ——极端嗜热生物。 研 究人 员选择 了嗜 热 古 菌 Sulfolobus acidocaldarius 。 这种 生物需要 在 75 ℃ 、 pH 2 的 极 端 环 境中生 长 ，而 现 有蛋白 荧 光 标签难 以在 这 一 条 件下保持 稳 定 并 正常工作，因此 长 期缺乏适用于其正常生 长条 件的蛋白特 异 性 荧 光成像工具 。 研 究 团队将 Rhobin9 分 别 融合到 S-layer 蛋白 SlaB 和染色 质 相 关 蛋白 Cren7 ，在 75 ℃ 下 实现 了低背景、蛋白特 异 性的活 细 胞 荧 光成像， 并进 一步通 过时间 序列成像 观 察到 细 胞分裂 过 程中染色体分离和 细 胞切割的 动态过 程 。 因此， Rhobin 不 仅 是一 个 可以用于哺乳 动 物 细 胞的 荧 光 标签 ，更 将遗传编码 的蛋白特 异 性 荧 光成像拓展到了 传统 天然蛋白 标签难 以覆盖的 极 端生命 环 境 。

总结和未来：

这个工作从实际生物成像需求出发，从头设计了兼具高亮度、可逆结合、小尺寸和极高稳定性的荧光标签蛋白Rhobin，并以很高的设计成功率实现了媲美甚至优于现有成熟工具的性能。Rhobin不仅能够用于常规细胞成像，还凭借可逆染料结合进一步支持STED超分辨和长时间单分子成像。更重要的是，Rhobin将蛋白特异性荧光成像拓展至75℃下生长的极端嗜热生物。

这项工作展示了从头蛋白质设计从“实现功能”走向“实用工具”，并进一步突破现有工具应用边界的潜力。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867426009347

文章共同一作（排名第一）的 陈 昱 达博士 即 将 入 职 北京大 学 化 学与 分子工程 学 院化 学 生物 学 系，担任 独 立 PI （特聘 研 究 员 、助理 教 授、博士生 导师 ）。 如果你希望在AI蛋白质设计，化学生物学、合成生物学和细胞生物学及其交叉方向开展研究，欢迎加入我们，共同探索具有新功能和新应用的人工蛋白质。请投递简历，应聘理由请注明“副研究员/博士后/博士生/科研助理申请+姓名”。

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