天津
脑缺血后再灌注会引发剧烈的氧化应激，导致神经元凋亡。本研究旨在探讨天然香豆素瑞香素是否通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，保护海马神经元免受氧糖剥夺/再灌注诱导的损伤。结果证实，瑞香素可减轻氧化应激和细胞凋亡，且该作用依赖于Nrf2/HO-1通路的激活。
一、研究背景
脑缺血/再灌注损伤的核心驱动因素是氧化应激——缺血期间积累的活性氧在再灌注时爆发性产生，攻击脂质、蛋白质和DNA，最终导致神经元凋亡。核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是细胞抗氧化防御的“总开关”，它能够启动下游一系列抗氧化酶和解毒酶的表达，其中血红素加氧酶-1（HO-1）是重要成员。既往研究发现瑞香素具有神经保护作用，但能否通过激活Nrf2/HO-1通路对抗缺血/再灌注损伤，尚缺乏直接证据。
二、研究目的
本研究利用原代培养的大鼠海马神经元，建立氧糖剥夺/再灌注模型模拟脑缺血/再灌注损伤，探讨瑞香素是否通过激活Nrf2/HO-1通路减轻氧化应激和神经元凋亡。
三、研究方法
本研究从新生SD大鼠大脑中分离海马组织，经机械分离和胰蛋白酶消化后，将细胞接种于聚-D-赖氨酸预处理的培养皿中，在B-27添加的神经基础培养基中培养7天，通过密度梯度离心纯化获得原代海马神经元。
氧糖剥夺/再灌注模型的建立方法为：将神经元置于无血清、无葡萄糖的培养基中，在37℃、含95% N和5% CO的缺氧环境下培养3小时，然后更换为含血清和葡萄糖的正常培养基，在常氧条件下继续培养24小时。瑞香素预处理组在氧糖剥夺前用10、20、40 μM瑞香素孵育12小时。
所有实验重复三次，数据以均值±标准误表示，多组比较采用单因素方差分析后Dunnett检验，＜0.05为有统计学意义。
四、研究结果
1. 瑞香素对海马神经元无毒性，并减轻氧糖剥夺/再灌注诱导的细胞损伤
在正常培养条件下，瑞香素浓度达到40 μM时对细胞活力无显著影响，因此后续选用10、20、40 μM三个浓度。氧糖剥夺/再灌注刺激后，细胞活力显著下降，乳酸脱氢酶释放显著增加（膜损伤标志）。瑞香素预处理以剂量依赖方式逆转了这两项变化——细胞活力回升，乳酸脱氢酶泄漏减少。这说明瑞香素能够保护神经元免受缺血再灌注样的损伤。
2. 瑞香素抑制氧糖剥夺/再灌注诱导的氧化应激
氧糖剥夺/再灌注导致细胞内活性氧水平升高3倍以上，脂质过氧化产物丙二醛也显著增加；与此同时，内源性抗氧化酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性则明显下降。瑞香素预处理（20、40 μM）显著降低了活性氧和丙二醛的水平，同时恢复了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。这表明瑞香素通过增强抗氧化防御系统，减轻了氧化损伤。
3. 瑞香素抑制氧糖剥夺/再灌注诱导的神经元凋亡
通过DNA片段化检测和凋亡相关蛋白表达分析，研究发现氧糖剥夺/再灌注刺激后，凋亡细胞比例显著升高，促凋亡蛋白Bax和裂解的Caspase-3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。瑞香素预处理后，凋亡细胞比例降低，Bax和裂解Caspase-3表达下调，Bcl-2表达回升。说明瑞香素能够阻断缺血再灌注诱发的细胞凋亡级联反应。
4. 瑞香素激活Nrf2/HO-1通路
氧糖剥夺/再灌注本身轻微诱导了Nrf2的核转位和HO-1的表达，但瑞香素（40 μM）处理后，核内Nrf2水平显著升高，HO-1蛋白表达也大幅增加。为了证实该通路的关键作用，研究者使用小干扰RNA敲低Nrf2。结果发现，敲低Nrf2后，瑞香素提高细胞活力、降低活性氧和减少凋亡的保护作用几乎完全被阻断。这直接证明：瑞香素的神经保护作用依赖于Nrf2/HO-1通路的激活。
参考文献
Zhi J, Duan B, Pei J, et al. Daphnetin protects hippocampal neurons from oxygen-glucose deprivation-induced injury[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(3): 4132-4139.
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