Nature Commun | 海南大学黄惜团队揭示热激蛋白与自噬协同抵御槟榔病毒新机制

近日，海南大学热带作物育种全国重点实验室黄惜教授团队在《Nature Communications》在线发表了题为“Small heat shock and J-domain proteins direct defense against areca palm velarivirus 1 by degrading coat protein via autophagy”的研究论文。该研究首次发现槟榔中的小热激蛋白和J-结构域蛋白能够作为选择性自噬受体，协同降解槟榔黄化病相关病毒APV1的衣壳蛋白，从而有效抑制病毒感染，为作物抗病毒育种提供了全新靶点。

槟榔黄化病是海南槟榔产业面临的最严重威胁，其病原APV1病毒的侵染导致槟榔叶片黄化、光合作用下降，并最终造成植株死亡。自噬和热激蛋白在病毒感染中一直被认为扮演着“双刃剑”的角色，但二者究竟如何协同发挥抗病毒功能，此前并不清楚。研究团队通过酵母双杂交筛选，找到了与APV1衣壳蛋白相互作用的两个宿主蛋白——一个归类为胞质I类的小热激蛋白AcsHSP和一个II型J-结构域蛋白AcDNAJB13。这两个蛋白都缺少跨膜结构域，可以在细胞质和细胞核中分布，并且它们在槟榔中的同源蛋白在本氏烟中也同样能够结合病毒衣壳蛋白。有意思的是，APV1侵染或者单独表达衣壳蛋白，都能够显著诱导这两个基因的转录上调，而这两个蛋白反过来又会抑制衣壳蛋白在植物细胞内的积累水平。利用VIGS技术分别沉默本氏烟中对应的同源基因后，病毒衣壳蛋白的积累量显著增加；而在本氏烟中过量表达槟榔的AcsHSP则能够明显降低病毒的侵染程度，说明这两个热激蛋白确实是植物抵抗病毒的重要因子。

研究团队进一步探究了衣壳蛋白被降解的具体途径。他们利用放线菌酮抑制蛋白质合成后发现，衣壳蛋白在植物细胞内很不稳定，并且这种降解会被自噬抑制剂E64D和3-MA所阻断，但蛋白酶体抑制剂MG132却没有任何效果，这提示衣壳蛋白是通过自噬通路而非泛素-蛋白酶体通路被清除的。共聚焦显微镜观察显示，衣壳蛋白能够和自噬体标志蛋白ATG8f1在细胞质中形成明显的点状共定位结构，并且当自噬通路关键基因ATG3A、ATG5、Beclin1或者ATG8f1被沉默之后，衣壳蛋白的稳定性都得到了显著增强，这些结果从多个角度证实了衣壳蛋白确实是被选择性自噬所降解。与此同时，研究团队还发现APV1侵染和衣壳蛋白表达本身就会激活植物的自噬通路——受侵染的槟榔和本氏烟中多个ATG基因的转录水平都上调了，ATG8-II脂化形式的积累也明显增加，透射电镜下更是能直接观察到受侵染细胞中大量出现的双层膜自噬体结构。这说明病毒侵染触发的自噬激活反过来又成了限制病毒增殖的武器，植物和病毒之间形成了一种动态的攻防平衡。

那么这两个热激蛋白究竟如何介导衣壳蛋白进入自噬通路呢。研究团队通过荧光素酶互补成像和双分子荧光互补实验证实，AcsHSP和AcDNAJB13都能够和AcATG8f1直接结合。有趣的是，这两个蛋白虽然都和衣壳蛋白以及ATG8f1互作，但它们对衣壳蛋白与ATG8f1结合的调控作用却完全相反。体外竞争性MBP pull-down实验显示，AcsHSP能够促进衣壳蛋白和AcATG8f1的结合，而AcDNAJB13则会削弱这种结合。此外，这两个蛋白在细胞内的分布也表现出差异：AcsHSP单独表达时会形成点状聚集体，但衣壳蛋白共表达后这些点状结构消失，而AcDNAJB13的分布始终均匀且不受衣壳蛋白影响；AcATG8f1和AcsHSP的复合体以不规则颗粒形式散布在细胞质中，但AcATG8f1和AcDNAJB13的复合体则主要定位于细胞膜和细胞核附近。这些发现表明，尽管两个蛋白都服务于同一个抗病毒目标，它们采取的分子策略和在细胞内的作用位点可能存在精细分工，AcsHSP更像是在“拉近”衣壳蛋白和自噬机器的距离，而AcDNAJB13可能通过别构调节或其他方式参与这一过程，具体的协同机制尚有待深入研究。当研究团队将衣壳蛋白上负责结合两个热激蛋白的N端区域删除后，截短形式的衣壳蛋白稳定性不再受AcsHSP或AcDNAJB13的影响，自噬结构的诱导能力也大幅下降，证明两个蛋白与衣壳蛋白的直接相互作用是启动自噬降解的前提条件。

这项工作首次报道了小热激蛋白和J-结构域蛋白作为选择性自噬受体参与植物抗病毒免疫，不仅拓展了人们对热激蛋白家族生物学功能的认识，也为槟榔黄化病的防控策略开发提供了新的分子靶点。该研究得到了国家自然科学基金和海南省农业产业技术体系等项目的资助。

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