上海
多重耐药菌感染已成为全球公共卫生领域的重大挑战。 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa ）作为医院感染的主要条件致病菌之一，对免疫力低下患者的生命健康构成极大威胁。该菌对抗生素日益严重的耐药性已成为临床感染治疗面临的主要挑战。在众多耐药机制中，耐药-结节-细胞分裂（ resistance-nodulation-cell division ，RND）家族外排泵的过表达是导致铜绿假单胞菌多药耐药的主要因素。 RND 外排泵是由 RND 转运蛋白、膜融合蛋白与外膜蛋白组成的跨膜复合体。 MexJK 外排泵 的发现源于 铜绿假单胞菌三氯生抗性突变株，目前关于该外排泵的结构和功能机制研究仍不清楚。
近日，武汉大学龙凤团队在 Science Advances 上 发表了题为 Structural insights into a substrate translocation pathway revealed by the RND efflux pump complex MexJK from Pseudomonas aeruginosa 的研究论文。该研究通过冷冻电镜技术，解析了铜绿假单胞菌RND转运蛋白MexK的结构（分辨率3.38 Å）以及其与膜融合蛋白MexJ和底物三氯生（triclosan）结合的复合物结构（分辨率2.57 Å）。 通过对 MexK 独特结构特征的分析，结合靶向分子动力学模拟和生化功能验证，研究 首次在RND转运蛋白中发现了一个位于跨膜结构域内部的新型底物结合口袋，并阐明了一条未报道过的、从细胞质侧摄取底物的HAE-1型RND转运蛋白的新型跨膜转运通道。
研究团队首先建立了 MexK 以及 MexJK 的表达纯化体系，并利用冷冻电镜技术解析了 apo- MexK 和 MexJK 与三氯生结合的复合物结构 （ MexJK -Tri ） 。 通 过与已解析的 RND 转运蛋白的 结构 进行比较，发现了 MexK 具有 较为独特的结构特征与构象状态。
该研究 的核心在于， 在 MexK 三聚体每个原聚体跨膜螺旋 TM2 、 TM3 、 TM4 和 TM6 形成的疏水口袋中 发现了底物三氯生的结合 。 通过 定点 突变和功能实验， 证实该口袋中 I367 、 V401 和 V483 残基是结合底物的关键氨基酸。 该结合 位点 与以往报道的 RND 转运蛋白的底物结合位点 均 不同， 大部分 RND 转运蛋白的底物 主要结合在周质结构域中 ，仅有少部分底物结合在跨膜螺旋外侧和三聚体中央空腔中 。这一发现极大地拓展了对 RND 外排泵底物识别多样性的认识。
基于发现的跨膜结构域内 部 的 底物 结合位点，研究团队 综合运用 通道预测、靶向分子动力学模拟以及通道附近残基功能验证 ，描绘 了 MexK 介导底物 跨膜转运 的完整 路径。 该路径的入口位于跨膜螺旋 胞质侧的 底部， 底物由此进入， 穿越跨膜区到达周质结构域，最终从出口通道排出。这种从细胞质直接摄取底物的转运通道，此前在 HAE-1 型 RND 转运蛋白中 从 未 报道 过 ， 之 前只报道过从周质空间和细胞膜外侧摄取底物的通道。该研究进一步丰富了 RND 转运蛋白底物 摄取的多样性路径 。
最后，研究团队通过药物筛选 发现氯霉素和乙胺嘧啶也可能是 MexJK 外排泵的潜在底物。这几种化合物的共同特征为均含有氯原子，且分子量较小，说明 M exJK 可能具有底物偏好性。 分子对接结果表明，这两种化合物能够以相似的结合模式结合于三氯生的结合口袋。更重要的是，上述转运通道中的关键残基突变同样削弱了菌株对氯霉素和乙胺嘧啶的耐药性，表明该转运通道可能具有底物通用性。
综上，该研究报道了RND转运蛋白中一个全新的底物结合位点，并揭示了一条底物跨膜转运路径。该研究不仅深化了对RND家族外排泵底物识别与转运机制多样性的理解，也为针对此类外排泵开发新型高效抑制剂提供理论基础，为临床上铜绿假单胞菌引发的感染以及多药耐药性防治提供潜在策略。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aee7036
制版人： 十一
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