Sci Adv丨从“识别”到“发光”：可催化转化的DNA立方体让活细胞中的RNA病毒无处遁形

近日，北京化工大学生命科学与技术学院苏昕教授、童贻刚教授团队在 Science Advances 发表题为 Direct visualization of RNA virus and evaluation of drug effect in living cells by catalytically transformable DNA cube 的研究论文。该研究开发了一种可催化转化的 DNA 立方体（ CAtalytically Transformable DNA Cube ，CAT-Cube） ，将病毒RNA识别、催化信号放大和高亮荧光输出构建于紧凑型DNA纳米结构中，实现了活细胞内RNA病毒的直接可视化，并进一步用于抗病毒药物作用效果及机制评价。

传统 RT-PCR 、免疫荧光和空斑实验等病毒检测方法通常依赖核酸提取、细胞固定或终点检测，难以连续观察病毒在活细胞中的动态变化；已有病毒荧光标记方法则往往需要对病毒进行基因工程或化学修饰。针对这一问题，研究团队设计了 CAT-Cube（图1）。该探针由刚性 DNA 立方体和多个催化发卡组成，当目标病毒 RNA 出现后，可触发发卡级联链置换反应并开启荧光信号。更重要的是， 病毒 RNA 在触发反应后能够重新释放并进入下一轮反应，而不是被长期束缚或消耗 ，从而实现循环催化和信号放大。同时， DNA 立方体将多个反应单元限域于纳米尺度空间，提高局部有效浓度，使 CAT-Cube 获得更快、更强的响应。体外实验显示，目标 RNA 产生的荧光信号约为阴性组的 3.8 倍 ；与游离发卡体系相比， CAT-Cube 具有明显更高的反应效率和信噪比。

图 1 用于检测 RNA 病毒的 “ 可催化转化的 DNA 立方体 ” （ CAT-Cube ）的示意图

除反应性能外， CAT-Cube 还表现出较好的成像性能和细胞适用性。单分子 TIRF 成像显示，在连续激光照射 30 秒后， CAT-Cube 仍能保留约 85% 的初始可检测荧光点 ，同时具有更高的光子输出和信噪比。 CAT-Cube 无需额外转染试剂即可自主进入 Vero E6 细胞，并在细胞内保持良好稳定性。研究团队进一步利用具有转录和复制能力的 SARS-CoV-2 trVLP 模型进行验证。随着感染时间延长或病毒感染剂量增加， CAT-Cube 产生的细胞内荧光信号持续增强，并可检测到低至 MOI 0.1 的病毒感染；即使提前在细胞中加载 48 小时，探针仍能够保持明显的病毒响应能力，证明其适合用于活细胞内病毒 RNA 的动态监测。

在此基础上，研究团队进一步利用 CAT-Cube 直接评价抗病毒分子的作用效果。 ACE2 抑制剂 MLN-4760 可使细胞内病毒相关荧光降低约 68.3% ；两种靶向 S 蛋白的 DNA 适配体在 100 nM 条件下分别使荧光降低约 69.2% 和 74.5% ，表明该体系能够直观反映不同抗病毒分子的抑制效果。研究还重点分析了天然产物 千金藤素（ Cepharanthine ，CEP） 的作用机制。活细胞成像结果显示， CEP 对病毒感染的抑制具有明显的时间和浓度依赖性； CEP 与病毒预孵育后，可使细胞内荧光降低约 67.9% 。进一步结合分子对接、分子动力学模拟和转录组分析，研究结果表明 CEP 可能同时与宿主细胞 ACE2 受体和病毒 S 蛋白 相互作用，从两个界面共同阻断病毒进入细胞，同时还可能通过调节宿主翻译相关过程产生进一步的抗病毒作用（图2）。

图 2 CAT-Cube 实时评估千金藤素的抗病毒效果，并揭示其同时靶向宿主 ACE2 和病毒 S 蛋白的 “ 双重封锁 ” 机制。

该研究建立了一种以病毒RNA本身为触发信号的活细胞成像策略，将DNA纳米结构、自主入胞、局部信号放大和高亮稳定成像结合起来，在无需对病毒进行额外遗传或化学标记的情况下实现病毒感染过程的动态观察，并进一步将分子检测拓展至抗病毒药物效果和作用机制评价。由于 CAT-Cube 的 RNA 识别序列具有可编程性，该策略未来有望进一步拓展至其他 RNA 病毒及疾病相关 RNA ，为病毒感染机制研究和抗病毒药物筛选提供新的技术工具。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aee2515

制版人： 十一

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