Science丨KAT2A的降解子非依赖性招募机制，扩展了CRBN分子胶的靶点空间

撰文丨章台柳

利用小分子实现疾病相关蛋白的靶向降解（TPD）是一种极具潜力的治疗策略，能够触及以往无法实现的药理作用，目前已有越来越多的分子进入临床开发阶段。机制上，TPD通过诱导E3泛素连接酶与目标靶蛋白（POI）之间的空间接近，利用细胞的泛素化机制，从而促进POI的多聚泛素化及随后的蛋白酶体依赖性降解。其中分子胶水（MGs）这种降解剂分子尤其引人关注，因为能够靶向那些由于缺乏明确的药物结合口袋而被认为“不可成药”的POI，例如转录因子。例如，多发性骨髓瘤药物来那度胺（lenalidomide）和泊马度胺（pomalidomide）通过重定向Cullin RING连接酶 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4CRBN），诱导淋巴样转录因子 IKZF1 和 IKZF3 的降解。

虽然分子胶水不需要POI上存在药物结合口袋，但对CRL4CRBN、分子胶水和POI三元复合物的结构研究表明，它们具有一个共同的降解子（degron）基序，称为β-发夹G-loop。因此，POI中G-loop的存在被认为是这些靶标的一个关键特征。这一认识促进了利用大规模计算方法对人类蛋白质组中与CRBN兼容的G-loop蛋白进行挖掘，为CRBN重定向分子胶水的开发鉴定了1400多个新靶点。然而，现有的可成药靶点空间仅占人类蛋白质组的约7%，而大多数蛋白（包括许多具有治疗意义的蛋白）缺乏G-loop。因此，发现能够招募含经典G-loop之外的POI的基于CRBN的分子胶水一直是该领域的主要目标。近期发现G3BP2的招募不依赖于G-loop降解子或结构模拟物，这表明这种非降解子依赖的招募是可行的，并且可能具有治疗开发潜力。

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）家族蛋白成员经常与致癌基因（如c-Myc、N-Myc、雌激素受体、雄激素受体以及融合致癌基因KMT2A）协同作用，维持恶性肿瘤程序。靶向KAT蛋白已显示出临床疗效；然而，对大多数KATs实现同源选择性仍然是一项重大挑战。

近日，来自Dana-Farber癌症研究所的Eric S. Fischer团队合作在Science杂志上发表文章Degron-independent recruitment of KAT2A expands the target space of CRBN molecular glues，开发了一种基于CRBN的非降解子分子胶水，可以诱导缺乏经典G-loop基序的POI——KAT2A的选择性强效降解。冷冻电子显微镜（cryo-EM）显示，CRBN在不依赖降解子的情况下招募KAT2A；而分子胶水与表面暴露的酪氨酸结合，模拟了类似抗体的分子识别。选择性降解KAT2A能有效消除组蛋白H3K9Ac，在急性髓系白血病细胞系中产生抗增殖作用，并在患者来源的异种移植模型中显示出体内疗效，确立了KAT2A作为治疗多种恶性肿瘤的可靶向目标。更普遍而言，非降解子依赖的招募机制扩展了CRBN可靶向的蛋白质组。

通过检索无靶标全局降解蛋白质组学数据库和免疫沉淀质谱数据库（其中包括数千个异双功能降解剂和分子胶水降解剂的数据点），研究人员获得了初步靶向KAT2A的分子胶水降解剂命中化合物。其中鉴定出化合物1是KAT2A的强效降解剂。化合物1最初是作为先前基于来那度胺核心结构衍生CRBN配体计划的一部分合成的，并且是整个数据库中唯一能诱导KAT2A降解的化合物。通过IP-MS等实验证明化合物1以依赖于CRBN和蛋白酶体的方式介导KAT2A的降解。同时体外重建系统显示全长KAT2A发生依赖于化合物1的泛素化，即化合物1充当了CRBN和KAT2A之间的直接分子胶水。根据先前的结构和AlphaFold2预测，KAT2A缺乏经典的G-loop基序或类似结构，提示其具有不同的结合模式。考察特定结构域的作用，发现化合物1存在的条件下，N端结构域发生多聚泛素化，招募界面位于KAT2A的N端结构域（KAT2A-NTD）内。且化合物1不会诱导KAT2B相应的N端结构域（KAT2B-NTD）发生多聚泛素化，确立了这种诱导相互作用的生化选择性。随后，研究人员对化合物1进行迭代优化得到化合物4。化合物4显示出强效的KAT2A降解，且消除GSPT1或GSPT2降解活性，对KAT2B没有降解作用。同时，4以剂量依赖性方式降低细胞中的组蛋白H3K9Ac，这是KAT2A的主要乙酰化靶点。通过全蛋白质组学和基于CRBN-IP的蛋白质组学证实，KAT2A是在4存在下唯一被强力招募到CRBN并降解的蛋白质。

由于KAT2A缺乏G-loop或类似结构，说明其招募机制不依赖于经典降解子。为了直观展示4如何诱导KAT2A招募到CRBN，研究人员解析了DDB1ΔB-CRBN-4-KAT2ANTD的2.9 Å分辨率冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 结构。结构显示出CRBN和KAT2ANTD之间由化合物介导的界面不仅缺乏G-loop结构基序，而且也不包含像VAV1中看到的典型基序的结构模拟物。相反，4通过一个球状螺旋结构域招募KAT2ANTD，该结构域由一个与4相互作用的溶剂暴露酪氨酸介导。整体排列由KAT2ANTD和CRBN之间的三个不同相互作用位点稳定。在化合物介导的界面处，4的庞大疏水基团包裹在KAT2ANTD α-螺旋内表面暴露的Y200周围。第二个界面，即“螺旋界面（Helix interface）”，形成于KAT2ANTD上的两个α-螺旋末端与CRBNCTD的锌配位区之间。第三个界面，即“环界面（Loop interface）”，形成于CRBNNTD上的F150与KAT2ANTD双核锌配位区附近的几个残基之间。这三个相互作用点每一个都有助于CRBN和KAT2A之间形成高亲和力的界面，并且对于KAT2A的识别是必不可少的。此外，KAT2ANTD掩埋了CRBNNTD和CRBNCTD的很大一部分，形成了一个广泛的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。KAT2A这种独特的结合模式，以及与经典免疫调节酰亚胺药物 (IMiD) 降解子的相异性——共同表明CRBN介导的降解的潜在靶点空间有了重大扩展。

最后，研究人员在体外和体内模型中证实化合物4介导的选择性降解KAT2A不仅在AML细胞系中显示出抗增殖活性，而且在PDX模型中显示出抗白血病活性。

总的来说，这项研究开发出一种降解子非依赖性CRBN分子胶水，能特异性强效降解KAT2A，从而降低H3K9Ac，显示出抗白血病活性。同时这种降解子非依赖的招募方式，扩展了CRBN介导降解的潜在靶点空间。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aef5391

制版人： 十一

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