Science丨血红素生物合成反馈调节的关键接头蛋白——POLDIP2

撰文丨章台柳

线粒体利用 AAA+ 家族中的去 折叠酶来维持并控制其蛋白质的活性。线粒体AAA+去折叠酶CLPX与肽酶CLPP形成蛋白水解复合体（CLPXP），对线粒体功能至关重要。 CLPXP 功能的紊乱是多种线粒体病的基础， 且 会驱动癌症进展。与 26S 蛋白酶体不同， CLPX 和其他线粒体去折叠酶在不依赖泛素化的情况下识别底物。 但是 这些去折叠酶 如何 对底物进行特异性和条件性识别 的机制尚不清楚。

CLPX 的重要作用 之一 是 通过作用ALAS（ 血红素生物合成第一步 的 限速酶 ） ，对线粒体 中血红素的合成 发挥双向 调控 作用。血红素作为脊椎动物红细胞中血红蛋白的一部分参与氧气运输， 且 作为多个酶家族的辅因子，并作为感应分子发挥作用。血红素生成不足会损害这些功能，而过量的 ALA 生成或血红素生物合成后期步骤的受损则会导致有毒血红素前体的积累和铁的耗竭。因此，血红素生物合成受到严格调控，尤其是在其起始点 ALAS 处。管家亚型 ALAS1 或红细胞特异性亚型 ALAS2 的功能或调控受损会导致多种形式的贫血和卟啉症，包括因 CLPX 突变引起的一种红细胞生成性原卟啉症。线粒体 CLPX 通过部分去折叠 ALAS 来激活它，从而加速 PLP 辅因子的掺入，以支持血红素生物合成和红细胞生成。相反，在脊椎动物细胞中，血红素充足的条件会诱导 CLPX 依赖性降解管家亚型（ ALAS1 ）和红细胞亚型（ ALAS2 ）两种同工酶。因此，血红素反馈重新引导 C LP XP 完成对 ALAS 的完全去折叠和降解。该降解需要一个半胱氨酸 - 脯氨酸（ CP ）血红素结合基序，该基序位于两种 ALAS 同工酶的柔性 N 端。在包含人类 CLPXP 和 ALAS 的重构系统中，仅简单添加血红素并不能重现这一降解过程， 这提示需要一种底物衔接蛋白来 介 导这一降解过程 。

聚合酶δ相互作用蛋白2（POLDIP2） 被认为能调节 CLPX 功能。 虽然 POLDIP2 是几种易错核 DNA 聚合酶的辅助因子，但它主要定位于线粒体基质。与 DNA 聚合酶发挥活性相关的关键接触位点包含在线粒体靶向序列中，因此在导入线粒体时被切除，这表明 POLDIP2 在线粒体中可能具有不同的功能。 POLDIP2 还能与 CLPX 相互作用并可能调节其功能，但其调节机制尚未确定。尽管通过免疫沉淀质谱和 酵母双 杂交筛选检测到了 POLDIP2 与 ALAS 之间的相互作用， 但 具体功能 未知 。

近日 ， 来自 美国 布兰戴斯大学 的 Julia R. Kardon 团队 在 Science 杂 志上发表文章 An adaptor for feedback regulation of heme biosynthesis by a mitochondrial protease ，发现POLDIP2是一种血红素感知接头蛋白，足以重构CLPXP对ALAS的负反馈降解。POLDIP2 是维持细胞内 ALAS 周转以及在红细胞生成过程中调控血红素生成所必需的。 POLDIP2 能够直接识别结合了血红素的 ALAS ，并将其招募至 CLPXP 。降解的起始需要 ALAS 的羧基末端元素，该元素的截短突变会导致红细胞生成性原卟啉症。研究确立了CLPXP条件性降解的机制，这一机制也是与CLPX和ALAS相关的红细胞生成性原卟啉症的基础。

为了测试 POLDIP 2 是否参与 CLPX 对 ALAS 的调控，研究人员利用重组人源蛋白 来 体外重构 CLPXP 对 ALAS 的降解。即使添加血红素， 单纯的 CLPXP 也无法降解 ALAS2 。然而，添加 POLDIP2 仅在存在血红素的条件下诱导 ALAS2 的降解。因此， POLDIP2 是重构 CLPXP 对 ALAS2 进行血红素响应性降解的充分必要条件。 在 HEK 293 细胞中，敲除 POLDIP2 导致 ALAS 1 丰度增加。即稳态条件下， POLDIP2 调控 ASAL 1 的周转。添加血红素后， ALAS 1 迅速降解，并在 3h 内接近完成。然而敲除 POLDIP2 则显著减少 ALAS 1 的降解。即 POLDIP2 对 ALAS 的血红素反馈降解极其重要。那么 POLDIP2 发挥作用的机制是什么？ 通过纯化蛋白的免疫共沉淀实验，研究人员发现 POLDIP2 直接结合 CLPX ，而 在血红素存在的条件下 招募 ALAS 到 CLPX 上。使用 AlphaFold 2- multimer 生成 ALAS 2- POLDIP2 复合物的模型，发现 POLDIP2 被预测以高置信度与 ALAS2 无序 N 端元件中的约 26 个氨基酸区域相互作用。该区域包括成熟 ALAS N 端区域内保守的血红素结合 CP 基序（ C70-P71 ），该基序是 ALAS1 的 CLXP 依赖性、血红素响应性降解所必需的 ，机制未知 。 进一步探究发现， ALAS2 的 N 末端元件是复合物组装所必需的，但不需要游离即可诱导 ALAS2 降解；而 ALAS2 的 C 末端元件对于复合物组装是可有可无的，但对于降解是必需的 。

ALAS - POLDIP2 复合物是如何感知血红素？ 由于 ALAS 中的 N 端 CP 基序对于血红素诱导的与 POLDIP2 的相互作用及降解至关重要，推测该基序可能通过直接配位铁来结合血红素。血红素的卟啉环为其结合的铁原子提供四个配体；血红素结合蛋白可以提供一个或两个轴向配体，从而在血红素的 Soret 带引起明显的位移。 结果显示， 在纯化的 ALAS2 存在下，血红素的吸光度峰值从近 390 nm 移动到 375 nm ，表明存在直接结合 。 在 POLDIP2 和 ALAS2 同时存在的情况下，血红素吸光度移动到了一个强峰 —— 近 425 nm 处 ，表明 ALAS2 和 POLDIP2 可能在复合物界面协同连接血红素。 突变关键氨基酸发现， C 70 是 ALAS 结合血红素的主要位点， H225 是 POLDIP2 识别血红素 - ALAS 的重要位点。

在红细胞生成性原卟啉病(EPP) 这种疾病中，倒数第二个血红素前体原卟啉 IX (PPIX) 在红细胞和前体细胞中积聚，并继发在皮肤中积聚，导致急性光敏性，在更严重的病例中伴有铁耗竭、肝脏积聚和毒性。这种疾病最常见的原因是由于血红素生物合成途径中的最后一种酶——亚铁螯合酶(FECH) 的隐性功能缺失等位基因所致。然而， C 末端截短的 ALAS2 会导致一种X连锁的红细胞生成性原卟啉病(XLPP) 。 尽管这种紊乱可能部分归因于酶活性的数倍增加， 但也可 归因于 C 末端自身抑制作用的丧失， 在 实验 中也发现 C 末端截短体 会导致细胞中 ALAS2 表现出周转率降低。因此， CLXP 对 ALAS2 降解的减少可能会加剧 XLPP 中 ALAS2 活性的过剩。 在红细胞模型系统中， POLDIP2 的缺失和 ALAS2 C 末端截短都会导致分化后的 小鼠红白血病 细胞中 ALAS2 蛋白过量，从而导致 PPIX 积累 。 这表明POLDIP2介导的降解对于调节红细胞生成过程中的血红素生物合成非常重要。

总的来说， 这项研究揭示了POLDIP2是血红素生物合成反馈调节中的关键纽带。POLDIP2将与血红素结合的ALAS呈递给CLPX，随后CLPX结合ALAS的C末端延伸部分，以便由CLPP进行去折叠和降解。这些数据确立了与CLPX和ALAS2相关的红细胞生成性原卟啉病的潜在机制，并表明POLDIP2的变异可能导致或改变红细胞生成性或肝性卟啉病。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.ads5397

制版人： 十一

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