优秀！研究成果登上Science、Mol Plant、Nat Plants等著名期刊，这个实验室总结木质素单体检测在农学领域的应用研究

一、GC-MS法在木质素单体分析中的应用与前景

木质素单体是构成植物细胞壁中复杂木质素高分子的基本结构单元，主要包括对香豆醇（H型）、松柏醇（G型）和芥子醇（S型）三种苯丙烷类醇化合物。由于其化学结构复杂且稳定性差，对木质素单体的精准检测对于理解木质素生物合成机制及推动其在材料科学、生物能源等领域的转化应用具有重要意 义 [1] 。其中，气相色谱-质谱联用（GC-MS）作为主流的木质素单体检测技术之一，因其高灵敏度和高分离效率而得到广泛应用。

GC-MS检测木质素单体的基本原理是通过保留时间和质谱特征离子实现化合物的定性分析，并采用内标法或外标法进行定量计算。由于木质素单体本身极性较强且挥发性较差，检测前必须对其进行衍生化处理——通常采用甲基化、三甲基硅烷化等方式将单体转化为易挥发的衍生物，以便进入气相色谱柱进行有效分离。目前常用的样品前处理方法包括硝基氧化法和硫代酸解法（Thioacidolysis），其中后者能更高效地断裂木质素中的烷基芳基醚键，释放H/G/S单体并通过GC-MS进行准确定量[2-3]。

随着多反应监测模式（MRM）等技术的引入，检测灵敏度得到进一步提升，GC-MS技术在木质素单体分析中优势明显，为木质素单体的高通量分析提供了更可靠的技术支撑。未来，该技术的优化与改进将在木质素功能评价和生物质资源高值化利用中发挥更加重要的作用。

二、木质素单体在农业领域的应用潜力

木质素是陆生植物中仅次于纤维素的高分子化合物，广泛存在于木质部导管分子、厚壁组织和韧皮部纤维中。作为植物细胞壁的关键组分，木质素不仅为植物提供机械强度和抗逆性保护，更因其独特的化学结构与生物活性而在现代农业中展现出广阔的应用潜力。木质素单体在农业领域展现出的应用潜力主要体现在以下几个方面[4-5]。首先，木质素单体中的酚羟基、羧基等活性官能团能够刺激植物根系发育，对作物生长产生积极影响。其次，木质素单体通过氧化聚合可形成三维网络结构，增强植物细胞壁的厚度和硬度，使植物能够抵御风雨等机械应力，提升抗逆性。这一特性对于增强作物对干旱、盐碱、低温等环境胁迫的适应能力具有重要意义。

在具体功能物质方面，某些木质素单体已显示出药用和工业价值。例如，松柏醇具有抗氧化和抗炎作用，也是合成抗肝炎药水飞蓟宾的重要中间体。芥子醇则是重要的化工中间体，可以合成工程纤维单体，同时也是优良的抗炎、抗感染药物原料。对香豆醇作为一种天然存在的酚类化合物，常用于食品防腐剂和香料工业[6]。此外，木质素中的酚类成分因其结构复杂、难分解的特性，是土壤有机碳的重要组成部分，与陆地生态系统的碳循环密切相关[7]。

三、土壤木质素单体检测在农学领域的应用研究相关文献分享

两种抗倒伏能力不同的玉米自交系在干旱适应中采用的不同细胞壁策略

英文标题:Diverging cellwall strategies for drought adaptation in two maize inbreds with contrasting lodging resistance

期刊名字：Plant,Cell & Environment

影响因子：6.3

DOI：https://doi.org/ 10.1111/pce.14822

1.研究内容

本研究以B73（抗茎秆倒伏）和EA2024（易茎秆倒伏）两份性状迥异的玉米自交系为试验材料，探究干旱胁迫下二者细胞壁重塑的差异化调控策略，解析玉米抗倒伏与抗旱性状之间的内在关联。表型与生理测定结果表明，抗倒伏自交系B73耐旱性显著弱于易倒伏自交系EA2024，干旱复水后B73无法存活，而EA2024可恢复正常生长。EA2024天然拥有更高纤维素、对香豆酸含量，保水能力更强。细胞壁组分分析显示，干旱促使EA2024木质素含量下降、阿拉伯聚糖与阿拉伯半乳聚糖等亲水多糖积累。B73则维持木质素总量不变，但木质素H单体减少、S单体及S/G比值上升，糖醛酸含量大幅提升，细胞壁重构程度更剧烈。转录组数据分析发现，干旱对B73基因表达的影响范围更广，细胞壁相关基因的表达模式存在明显自交系特异性，尤其木质素合成通路基因分化最为显著，PAL、C4H、CAD等关键基因表达差异直接造成木质素组分改变。研究还通过免疫检测明确了两类玉米果胶、半纤维素的结构变化规律，并筛选出MYB、WRKY、ABI等参与干旱应答的特异性转录因子及其调控网络。综合分析证实，B73为适配抗倒伏性状形成了刚性强、可塑性低的细胞壁结构，进而削弱了干旱适应能力；而EA2024细胞壁可塑性高，更易通过组分重塑抵御干旱。该研究阐明了玉米抗倒伏与抗旱的拮抗关系，为培育兼具抗倒伏、抗旱特性的玉米新品种提供了理论依据与候选基因资源。

2.样本处理

本研究分多组样本开展培育与检测。玉米自交系B73、EA2024分环境培育：转录组材料于气候箱培养至三叶，分别干旱7、9、10d。生理与细胞壁样品温室干旱10d。另设25d重度干旱复水试验，各组均混合5株地上组织，2个生物学重复。生理叶片测定鲜重、膨重、干重计算相对含水量，使用光合仪检测气体交换指标。茎秆粉末经甲醇浸提得到细胞壁醇不溶残渣，依次用CDTA、稀碱、浓碱分级提取果胶与半纤维素组分，通过GC、HPLC、免疫斑点检测木质素、多糖、酚类物质，每项3次技术重复。不同干旱时间点植株提取总RNA，构建双端测序文库，数据比对玉米参考基因组；利用DESeq2筛选差异基因，maSigPro分析时序表达，qRT-PCR验证基因，以LUG为内参。最后整合差异细胞壁基因做转录因子富集，借助软件构建基因型特异调控网络，完整配套多维度样本前处理与分子检测流程。

3.研究结果

①B73与EA2024对干旱胁迫的表型响应态

将B73、EA2024玉米幼苗培养至三叶期，停水10d进行干旱处理。宏观表型观察显示：干旱对B73损伤程度远高于EA2024（图1）。处理10d后测定叶片相对含水量（RWC），无论正常供水还是干旱条件，EA2024叶片保水能力均优于B73。

测定气体交换与叶绿素荧光参数评估植株光合性能，正常供水下，两份自交系PSII实际光化学效率（ΦPSII）、电子传递速率（ETR）、CO2同化速率（A）、胞间CO₂浓度（Ci）无显著差异；但EA2024蒸腾速率（E）显著低于B73。干旱后，EA2024胞间CO₂浓度上升，B73无明显变化。停水25d后复水，检验极端干旱后植株恢复能力：B73全部死亡，EA2024复水1周后完全恢复正常生长表型（图1）。

综上，生理表型结果为茎秆抗倒伏自交系B73干旱敏感，茎秆易倒伏自交系EA2024干旱耐受性更强，二者干旱生理响应存在本质差异。

图1.B73和EA2024在干旱下表现出的表型变化。

②干旱对B73、EA2024细胞壁重塑的影响

研究测定干旱处理10d植株茎秆木质素、多糖含量。采用克拉森法测定木质素总量，硫代酸解-气相色谱质谱联用解析木质素单体组分。结果显示，干旱不改变B73木质素总量，但EA2024茎木质素含量下降20%（图2）。反之，干旱不改变EA2024木质素单体组成，B73则出现H单体减少、S单体与S/G比值上升（图2）。两份自交系经硫代酸解释放的H、G、S单体总量均上升，说明干旱会降低木质素聚合程度。

图2.B73和EA2024在对照和干旱条件下的木质素含量和组成。

细胞壁多糖结果为，正常供水下EA2024纤维素含量高于B73。干旱后两份自交系纤维素含量均上升10%（图3）。总半纤维素在两份自交系中含量相近、不受干旱影响；干旱后EA2024细胞壁葡萄糖含量上升60%，B73糖醛酸含量上升60%（图3）。本研究同时定量细胞壁酯键连接羟基肉桂酸（图4），正常供水下EA2024酯化对香豆酸含量高于B73，干旱无显著改变；两份自交系酯化阿魏酸、交联二阿魏酸含量相近，干旱无显著变化。干旱仅小幅但显著提升EA2024阿魏酸/对香豆酸比值（图4）。

图3.在控制和干旱条件下培养的B73和EA2024的细胞壁多糖组成。

图4.B73和EA2024在对照和干旱条件下生长的植物细胞壁羟基肉桂酸组成。

对细胞壁分级提取，区分钙离子桥联果胶（CDTA组分）、弱交联半纤维素（KI组分）、强交联半纤维素（KII组分），探究干旱对多糖分布的影响（图5）。B73遭遇干旱后KII组分总糖（可提取半纤维素）上升，CDTA、KI组分无变化，KII/KI比值升高。EA2024仅CDTA果胶含量小幅下降，半纤维素分配无变化。两份自交系糖醛酸含量、分布对干旱响应存在差异（图5）。正常供水下EA2024交联糖醛酸总量高于B73，但CDTA可溶性糖醛酸含量低于B73（图3、图5）。干旱后EA2024 CDTA组分糖醛酸上升，B73该组分糖醛酸下降；B73糖醛酸最显著变化出现在KI、KII组分，分别上升1.5倍、3.5倍（图5）。

图5.来自B73和EA2024的细胞壁半纤维素组分在正常和干旱条件下的总糖含量。

采用完整免疫斑点检测（IDA）与热图分析表征CDTA、KI、KII组分细胞壁多糖精细结构（图6）。干旱条件下，相较于对照组，B73 KI组分低甲酯化同型半乳糖醛酸（HG，JIM5抗体识别）增多，RG-I阿拉伯聚糖侧链（LM6抗体识别）减少。KII组分RG-I阿拉伯聚糖侧链减少、半乳聚糖侧链（LM5抗体识别）增多。

EA2024细胞壁干旱重塑幅度高于B73。CDTA组分低甲酯化HG含量上升。KI组分低甲酯化HG下降，同时部分甲酯化HG、阿拉伯半乳聚糖蛋白、非岩藻糖基木葡聚糖含量上升。KII组分RG阿拉伯聚糖侧链含量上升。综上，干旱改变两份自交系三类细胞壁组分，但EA2024 KI组分变化最为剧烈。

图6.细胞壁表位免疫检测的热图。

③干旱诱导细胞壁相关基因（CWGs）表达变化

本研究选取停水7、9、10天取样进行RNA双端转录组测序，序列比对至B73参考基因组后采用DESeq2筛选差异基因（log₂|FC|＞1且校正P＜0.05），主成分分析显示94%变异由两因子解释（自交系固有差异PC1占66%，干旱响应差异PC2占28%）。全基因组尺度下干旱分别调控B73的29%和EA2024的21%基因；针对整理的1485个细胞壁相关基因（涵盖纤维素、半纤维素、果胶、膜/细胞壁蛋白、木质素、木栓质、胼胝质、蛋白酶及转录因子编码基因），干旱调控B73中44%、EA2024中31%细胞壁基因，均高于全基因组调控水平。韦恩分析显示下调趋势更显著：B73下调513个（34.5%）、EA2024下调358个（24.1%），其中311个同步下调；上调方面B73为137个（9.2%）、EA2024为106个（7.1%），62个同步上调。另有8个细胞壁基因在两自交系中响应方向完全相反，包括B73上调而EA2024下调的C4Hb（肉桂酸4-羟化酶）与蔗糖合成酶，以及B73下调而EA2024上调的3个过氧化物酶（参与木质素合成/活性氧生成）、1个果胶降解多聚半乳糖醛酸酶、1个糖基转移酶14及1个金属内蛋白酶。

图7.在全基因组和细胞壁基因目录中，干旱10天后基因表达变化的百分比及细胞壁基因的维恩图分布。

④干旱对不同功能类别细胞壁基因的影响

本研究将细胞壁基因（CWGs）分为纤维素/半纤维素生物合成、果胶生物合成、膜结合与细胞壁蛋白（MB/CWP）、木质素生物合成及木栓质/胼胝质沉积五类，每类约50%基因受干旱影响，其中木质素类比例最高（55%）。按自交系影响模式可分为两类：C/HC和木质素类中仅单自交系受影响基因占多数，如C/HC类别中仅B73受影响的90个基因超过两系共有的83个基因，木质素类64个仅B73受影响/30个仅EA2024受影响也呈现类似模式（图8，9）。而果胶、MB/CWP等其他类别的DEGs主要在两系中共现。具体来看，纤维素生物合成中大多数纤维素合酶A（CesA）基因在两系中均被下调，仅B73的CesA2被上调；半纤维素方面糖基转移酶（GT）家族响应差异显著，EA2024中9个差异GT基因有6个上调而B73无变化，另一组GT基因则仅在B73差异调控（10上调/24抑制）。果胶相关基因在B73中受影响更大，而G/GalT家族受影响基因数则在EA2024中更多；MB/CWP蛋白中B73受影响基因数量始终高于EA2024。木栓质生物合成中多种GELPs酯酶在两系均被抑制。木质素途径差异最为明显（图10），B73中三种PAL被抑制且C4Hb、C3H/APX及O-甲基转移酶被诱导，提示对羟基香豆酸向阿魏酸代谢流增加，而EA2024中三种PAL被诱导（PAL2为其PTAL同源物）。三种过氧化物酶更是呈现相反响应（B73抑制/EA2024诱导）。这些结果表明干旱通过品系特异性机制调控细胞壁合成与修饰通路，其中参与纤维素、半纤维素和木质素合成的基因主要在B73中受干旱影响，而其他类别基因在两系间反应较相似。

图8.细胞壁基因（CWGs）的表达受10天干旱影响。

图9.B73/EA2024中受干旱影响的基因在功能性CWG类别中的分布。

图10.玉米木质素生物合成途径的示意图。

⑤B73与EA2024细胞壁基因时序表达动态

采用maSigPro包（R＞0.6）分析7、9、10d干旱时序细胞壁基因表达，1485个细胞壁基因中1000个被分为9个表达簇。簇1、2为非自交依赖型，簇1（160个）两份同步下调、时序一致。簇2（152个）两份同步上调、时序一致。簇3–9为自交依赖型：基因本底丰度、干旱诱导趋势两份自交系存在差异。不同功能类群自交依赖型基因占比不同：木质素基因81.5%为自交依赖型；膜细胞壁蛋白仅59.6%为自交依赖型；纤维素半纤维素、果胶、木栓胼胝质介于二者之间（图11）。

图11.B73和EA2024植物在对照条件下或经历7、9和10天干旱处理下的细胞壁基因表达谱。

⑥自交系特异性调控细胞壁基因的转录因子鉴定

基于两份自交系7、9、10d干旱差异细胞壁基因，在PlantRegMap平台完成转录因子富集分析，利用Cytoscape绘制调控网络，筛选28个高显著性自交系特异性转录因子。12个归为4个B73特异性子簇（图12），16个归为5个EA2024特异性子簇。多数子簇包含全部类别细胞壁基因，但子簇9（EA2024特异）、子簇43（B73特异）富集纤维素、半纤维素合成基因；子簇9全部为WRKY转录因子，B73特异子簇40、41、42分别为MYB、IDD、ABI家族。

3类调控苯丙烷通路的转录因子存在自交特异性：B73特异子簇42的P1（黄酮调控）、子簇40 MYB19（拟南芥、玉米苯丙烷通路激活因子）。EA2024特异子簇6 MYB31（脱落酸依赖干旱响应调控）。另有5个参与脱落酸信号的转录因子：B73特异ABI3/VP1、ABI19、MYB162。EA2024特异GBF1、HB128。PIF3、MYBST1（EA2024特异）同源基因受生物钟调控。综上，转录因子富集与调控网络分析鉴定出多套自交系特异性转录因子，可调控细胞壁基因表达。

图12.B73和EA2024自交系中特异性的转录因子和CWG调控网络。

4.结论

本研究以抗倒伏B7、易倒伏EA2024两份玉米自交系为材料，解析干旱下细胞壁差异化适应机制。生理层面，EA2024保水能力更强，干旱后可完全复水恢复，B73干旱致死，证明抗倒伏基因型耐旱性更弱。生化结果显示，正常供水EA2024纤维素、对香豆酸、糖醛酸含量更高。干旱后EA2024木质素下降，富集阿拉伯糖果胶与阿拉伯半乳聚糖蛋白。B73木质素S单体、S/G比值上升，半纤维素糖醛酸大幅积累，细胞壁重构程度更深。转录组表明干旱对B73基因扰动更强，44%细胞壁基因差异表达，显著高于EA2024的31%。木质素、纤维素合成基因存在极强基因型特异性，8个关键基因二者干旱表达趋势完全相反。时序聚类显示超80%木质素基因存在自交依赖表达模式。转录因子筛选得到MYB、WRKY、ABI等基因型特异调控因子，分别调控两条细胞壁通路。B73为实现茎秆刚性提升、获得抗倒伏特性，牺牲了细胞壁可塑性，面对干旱需剧烈重塑细胞壁。EA2024细胞壁结构灵活，依靠高阿拉伯糖果胶维持水分，耐旱性更优。研究挖掘的细胞壁基因与转录因子，可用于培育兼顾抗倒伏与耐旱的玉米新材料。

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（实验室部分拍摄）