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蛋白质测序技术是生命科学研究的基石，但传统方法如Edman降解和质谱在分析低丰度肽段、复杂混合物及翻译后修饰（PTM）时存在固有瓶颈。南京大学应佚伦教授、龙亿涛教授和杨程教授团队在《Nature Communications》杂志发表了题为“Exopeptidase-assisted nanopore peptide sequence identification”的研究论文，该团队开发出一种名为EANPSeq的外肽酶辅助纳米孔策略，该策略通过构建肽段文库和机器学习模型，实现了对肽段连续序列的高精度识别和单个氨基酸差异的分辨。
研究团队对气单胞菌溶素（AeL）纳米孔进行了工程化改造，构建出T274L/N226Q/S228K（LQK AeL）三重突变体。该突变体显著增强了纳米孔与肽段间的静电相互作用，将肽段在孔内的滞留时间延长至野生型的数倍以上，从而为每个肽段分子提供了信息更丰富的电流指纹信号。基于该突变体，团队首先建立了一个“缩短肽段文库”，用于鉴定肽段长度。他们利用羧肽酶Y（CPY）对模型肽段P12进行逐位C端酶切，并在多个时间点取样检测。机器学习模型对酶解产物的分析结果显示，P12可被逐步水解为P11至P7等一系列明确长度的片段，并且该过程可有效分辨肽段中连续存在的相同氨基酸残基，解决了此前游离氨基酸检测法在重复序列识别上的核心难题。
在确定片段长度的基础上，团队进一步构建了包含20种天然氨基酸单一位点突变的“突变肽段文库”。他们通过提取电流事件在时域、频域和时频域的48个特征，并采用Bagging集成分类器进行训练，该模型对20条仅第5位氨基酸不同的8肽实现了90.1%的分类准确率。随后，研究团队发现，电流阻断程度、协方差和样本熵等特征与肽段的偶极矩等物理化学性质高度相关，而相对分子质量对信号差异的贡献反而较小。
为了验证完整的序列解码流程，团队将CPY酶解产生的未知片段数据先后与“缩短文库”和“突变文库”进行比对。通过对多个酶解时间点的数据交叉验证，P12-5I的序列被唯一且正确地判定为RHFSIGED。该策略的核心优势在于，每个最终序列均得到来自多个时间点独立数据的反复确认，有效降低了假阳性率。在更困难的PTM位点识别任务中，团队精准定位了含连续天冬氨酸（D）残基肽段中的异天冬氨酸异构化位点。由于CPY无法切割异天冬氨酸前的肽键，酶解会止步于修饰位点前，从而清晰区分修饰位于第9位或第8位。这种不依赖化学标记的检测方式为难以通过常规质谱区分的等质量修饰提供了全新的单分子鉴定路径。EANPSeq为单分子蛋白质测序提供了一种可行且高效的新范式。
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