中药药对的药效物质基础、配伍比例如何研究，且看这篇《Phytomedicine》：黄芪-丹参、脑缺血再灌注损伤

【写在前面】：本期推荐的是由第四军医大学西京医院药学系等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示将UHPLC-HRMS与SSA-BP神经网络集成，确定黄芪-丹参组合的最佳成分，通过有丝分裂和铁死亡减轻脑缺血再灌注损伤。

本文主要亮点：

1.丹参（QD）可以显著改善神经功能，减少脑梗死面积和神经元损伤，其中3:2QD的组合效果最好。

2.UHPLC-HRMS分析显示，五种主要活性成分（黄芪甲苷IV、黄芪甲苷II、紫草酸、丹参酮IIA和钙苷）可能是QD抗脑缺血损伤的活性成分。

3.使用Sparrow搜索算法和反向传播（SSA-BP）神经网络预测QD组件的最佳组合。

4.先进的4D无标记蛋白质组学分析表明，有丝分裂吞噬调节和铁凋亡抑制是QD的主要治疗途径。

5.机制研究证实，QD通过双重作用发挥神经保护作用——恢复线粒体稳态（通过FUNDC1和UQCRC2）和抑制铁下垂（通过GPX4/SLC7A11/Nrf2途径），从而全面了解其作用。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Integrating UHPLC-HRMS with SSA-BP neural network identifies optimal components of Astragali Radix‑Salviae Miltiorrhizae combination for mitigating cerebral ischemia-reperfusion injury via mitophagy and ferroptosis pathways

背景

黄芪（Huangqi）和丹参（Danshen）是中国传统医学中一种常见的补气活血的草药组合。先前的药理学研究表明，来自这些草药的植物化学物质对脑缺血再灌注（CI/R）损伤具有神经保护作用。然而，在缺血性卒中管理中，黄芪和丹参联合应用的基本原则及其治疗效果所涉及的分子途径仍未得到探索。

目的

本研究旨在系统地研究QD制剂中的生物活性成分，并阐明其抗脑缺血损伤的作用机制。

材料与方法

在小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中评估QD的治疗效果。UHPLCHRMS用于鉴定血液和脑组织中的QD衍生成分。构建SSA-BP神经网络来预测活性成分的最佳组合。进行4D无标记蛋白质组学，结合GO和KEGG富集分析，以确定关键途径。分子对接和分子动力学模拟用于验证候选靶点。通过测量ROS、线粒体膜电位（ΔΨm）、ATP、复合物I活性、Fe2+和GSH/GSSG比值来评估线粒体功能和铁稳态。Western印迹和免疫荧光用于检测FUNDC1、Nrf2、SLC7A11、NCOA4、p62、FTH1、UQCRC2和GPX4。自噬抑制剂3-MA用于机制验证。在细胞研究中，对HT22细胞进行氧葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R），并在复氧过程中加入QD。分别使用CCK-8和LDH测定法评估细胞存活率和细胞毒性。使用商业试剂盒测量ROS、ΔΨm、Fe2+和GSH。采用蛋白质印迹法分析FUNDC1、UQCRC2、LC3-II/I、p62、GPX4、SLC7A11、NCOA4、Nrf2和FTH1。在OGD/R前48小时转染siFUNDC1以评估FUNDC1依赖性。

结果

在测试的比例（1:1、2:1、3:1、3:2和2:3）中，3:2 QD组合是最有效的，显著改善了MCAO小鼠的神经功能，减少了梗死面积，减轻了神经元损伤。UHPLCHRMS鉴定出21种被吸收到血液中的化合物，其中7种在脑组织中检测到。黄芪甲苷IV、黄芪甲苷II、紫草酸、丹参酮IIA和毛蕊异黄酮被鉴定为关键活性成分。SSA-BP神经网络预测，它们的组合在体内发挥了显著的神经保护作用。蛋白质组学揭示了124种差异表达的蛋白质，GO和KEGG富集分析表明，有丝分裂吞噬和铁下垂是主要的治疗途径。分子对接和动力学分析揭示了QD成分与关键靶标（包括FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11）之间的高亲和力结合相互作用。QD上调FUNDC1、UQCRC2、GPX4、SLC7A11、Nrf2和FTH1，下调p62和NCOA4；在HT22细胞中，QD提高了细胞存活率，减少了LDH释放，恢复了ΔΨm和GSH水平，并减弱了ROS和Fe²⁺ OGD/R后的积累。蛋白质表达变化与体内观察到的一致。FUNDC1的敲除在很大程度上阻断了QD的保护作用，证实了FUNDC1对QD介导的神经保护至关重要。

结论

QD通过丝裂原吞噬和铁死亡改善MCAO诱导的脑缺血损伤，为益气活血中药治疗缺血性卒中提供了新的治疗前景。

【前言】

缺血性中风（IS）是一种普遍且毁灭性的神经系统疾病，其特征是发病率高、严重残疾和死亡率高，从而给全球健康带来了重大负担。IS不仅会导致原发性脑损伤，还会通过能量代谢紊乱、氧化应激、兴奋毒性和炎症加剧继发性脑损伤。重组组织型纤溶酶原激活物（rt-PA）溶栓和机械血栓切除术可以改善卒中结局，但狭窄的治疗窗口和严格的禁忌症限制了它们在一小部分患者中的使用。在中国，2019年至2020年间，接受药物溶栓治疗的IS患者不到5.64%，只有1.45%接受了机械血栓切除术。因此，确定其他有效的治疗策略仍然是一项紧迫的临床需求。线粒体以双层膜结构为特征，是真核细胞能量生产和基本生物过程的中心枢纽。在生理条件下，线粒体的数量、形态和功能保持相对稳定，这种状态被称为线粒体稳态。当线粒体功能受损时，细胞能量供应和重要生物活动受到损害，导致线粒体稳态失调。脑缺血破坏线粒体稳态，导致结构和功能损伤，包括线粒体肿胀、膜电位降低、能量代谢受损和凋亡途径激活，最终导致神经元死亡。线粒体稳态对于脑缺血后神经元的存活和功能恢复至关重要。缺血损伤后，受损的线粒体通过线粒体吞噬去除，而完整的线粒体成分支持线粒体生物合成。报告称，急性缺血后线粒体稳态被破坏。脑缺血期间线粒体分裂、融合和自噬的中断是细胞器功能障碍的主要原因。值得注意的是，线粒体衍生的ROS（mtROS）催化脂质过氧化，进而引发铁死亡铁依赖性的受调节细胞死亡的特征是氧化脂质损伤、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）耗竭和ROS过度积累。其病理生理相关性涵盖多种疾病状态，包括神经退行性疾病、缺血性组织损伤和肝纤维化。新的证据表明，铁下垂受铁代谢网络和一种特殊形式的自噬的调节。具体而言，铁素体吞噬控制细胞铁平衡，而线粒体吞噬维持线粒体完整性。这些见解突出了靶向线粒体吞噬和铁下垂以恢复线粒体稳态的治疗潜力。因此，通过调节线粒体吞噬和铁下垂来重塑线粒体功能，可能为改善脑缺血性损伤提供一种有前景的策略。

中医药在缺血性中风的预防和治疗方面显示出了希望。在中医框架内，“气虚血瘀”被认为是IS的核心病理机制。因此，益气活血被视为主要的治疗策略。在中医理论中，气代表着支配生理功能的生命力，而血液和体液是由气运动驱动的物质表现。现代生物学研究表明，线粒体是负责能量代谢的细胞动力库，导致气和线粒体功能之间存在概念上的相似性。气循环和线粒体生物能量学之间的动态相互作用反映在它们在物质转化和能量生产中的共同作用上。临床观察表明，最佳的气血状态与线粒体效率的提高相关，反映了全身能量稳态。有人提出，中医补气与线粒体功能有内在联系。先前的研究还表明，铁超载组的血瘀评分明显高于非铁超载组，铁超载与血瘀呈正相关。这些发现表明，血瘀参与了铁超载的过程，这可能是铁超载诱导的铁死亡的关键致病机制。因此，抑制铁死亡可能是促进血液循环的重要途径。

黄芪和丹参是益气活血方中常用的草药，如黄芪丹参汤、芪参益气滴丸和芪参通络胶囊。先前的研究表明，黄芪甲苷IV改善线粒体功能障碍，缓解糖尿病肾病，并通过Keap1/Nrf2/HO-1轴抑制铁死亡减轻III型CP病理损伤。同样，黄芪的一种成分毛蕊异黄酮通过Nrf2/SLC7A11/GPX4途径缓解铁下垂并减轻阿霉素诱导的心肌损伤。丹参中的生物活性化合物也被报道可以调节线粒体功能和铁下垂。丹酚酸B调节自噬以缓解糖尿病内皮和线粒体功能障碍，而丹参酮IIA通过保护线粒体和促进自噬来减少奥沙利铂诱导的神经毒性。丹酚酸A通过AMPK-PGC1α途径促进3T3-L1脂肪细胞线粒体功能稳态。此外，我们最近的研究结果表明，丹参素钠可以缓解铁死亡，改善线粒体功能障碍，从而对脑缺血具有保护作用。总的来说，这些发现表明QD增强线粒体功能并抑制铁死亡。然而，QD联合治疗缺血性卒中的疗效及其潜在机制尚不清楚。在本研究中，我们建立了MCAO小鼠模型，以研究QD治疗缺血性卒中的配伍原理和药理学特性。我们进一步阐明了其治疗机制，重点研究了其通过调节线粒体功能和铁下垂来对抗脑缺血损伤的作用。

【结果部分】

1.黄芪-丹参3∶2配伍对脑缺血再灌注损伤的改善作用最明显

研究首先比较了黄芪与丹参1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和2∶3五种配伍比例，并以通心络胶囊作为阳性对照。MCAO术后1小时开始灌胃给药，每日1次，连续3天。

与假手术组相比，MCAO模型小鼠出现明显神经功能缺损。黄芪-丹参3∶1、3∶2及2∶3配伍均可降低神经功能缺损评分，并改善胶带去除实验所反映的触觉感知和运动协调能力。

TTC染色显示，MCAO模型组出现明显脑梗死。与模型组相比，黄芪-丹参2∶1、3∶1、3∶2和2∶3配伍均可显著缩小梗死面积。

H&E染色显示，MCAO模型小鼠脑皮质出现明显的细胞核固缩和神经元死亡。黄芪-丹参3∶2配伍可明显减轻上述组织学损伤。综合神经功能、行为学、梗死面积和组织学结果，研究将3∶2确定为后续实验的主要配伍比例。

2.UHPLC-HRMS鉴定黄芪-丹参入血及入脑成分

3.SSA-BP神经网络筛选并验证五种活性成分组合

4.蛋白质组学将关键作用机制指向线粒体自噬和铁死亡

5.活性成分与FUNDC1、UQCRC2、GPX4及SLC7A11具有较高预测结合亲和力

6.黄芪-丹参改善线粒体功能并减轻铁死亡相关改变

7.黄芪-丹参调节线粒体自噬和铁死亡相关蛋白

8.细胞实验进一步证实黄芪-丹参可恢复线粒体自噬并抑制铁死亡

9.FUNDC1是黄芪-丹参恢复线粒体自噬和抑制铁死亡所必需的关键节点

【结论与讨论】

总之，我们的研究结果表明，QD通过促进适度的有丝分裂和抑制铁下垂来保护大脑免受I/R诱导的神经元损伤。因此，本研究为中医药的多途径机制提供了证据，并加强了其制剂原理在缺血性卒中治疗中的价值。

注：本文原创表明为原创编译，非声张版权，侵删！

中医药基础科研技术服务及加群交流：

相关咨询，加微信：1278317307。