Phytomedicine｜黄芪-丹参3∶2配伍为何更优？神经网络锁定“五成分组合”，通过FUNDC1线粒体自噬抑制铁死亡！(王婧雯/郭超—西京医院)

2026年7月28日，空军军医大学西京医院药剂科郭超、王婧雯 教授团队在Phytomedicine（中科院1区，TOP期刊，IF=11.3）在线发表题为“Integrating UHPLC-HRMS with SSA-BP neural network identifies optimal components of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae combination for mitigating cerebral ischemia-reperfusion injury via mitophagy and ferroptosis pathways”的研究论文。该文于2026年5月6日投稿，6月24日修回，7月26日接收。

黄芪与丹参是中医益气活血法中的常用药对，但针对脑缺血再灌注损伤，两者采用何种配伍比例更合适、哪些成分真正能够入血入脑，以及多成分协同作用的关键机制，仍缺少系统证据。

研究团队首先比较了黄芪-丹参1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和2∶3五种配伍比例。结果显示，3∶2配伍在改善神经功能、缩小脑梗死面积和减轻神经元损伤方面表现最突出。随后，研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）鉴定出21种入血成分，其中7种可进入脑组织。

在此基础上，研究引入麻雀搜索算法-反向传播神经网络（sparrow search algorithm-back propagation neural network，SSA-BP），从3125种候选配方中筛选出由黄芪甲苷、黄芪皂苷II、紫草酸、丹参酮IIA和毛蕊异黄酮组成的五成分组合，并通过小鼠实验验证其神经保护作用。

4D非标记定量蛋白质组学进一步将作用机制指向线粒体自噬和铁死亡。研究发现，黄芪-丹参配伍可恢复FUNDC1介导的线粒体自噬，改善线粒体膜电位、ATP生成和呼吸链复合物I活性，同时调节Nrf2/SLC7A11/GPX4抗铁死亡系统及NCOA4介导的铁蛋白自噬，减少活性氧和Fe²⁺积聚。

在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的HT22神经元损伤模型中，敲低FUNDC1后，黄芪-丹参配伍对细胞活力、线粒体功能及铁死亡相关蛋白的调节作用大幅减弱，进一步表明FUNDC1是连接线粒体自噬与铁死亡调控的重要节点。

需要注意的是，本研究的证据主要来自小鼠脑缺血模型和细胞实验。SSA-BP神经网络筛选出的五成分组合尚未经过人体研究，其最佳临床剂量、治疗时间窗、药代动力学和长期安全性仍需进一步验证。

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【摘 要】

背景：黄芪与丹参是中医益气活血法中的常用配伍。既往药理学研究表明，两种药材中的植物化学成分对脑缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CI/R）损伤具有神经保护作用。然而，在缺血性脑卒中治疗中，黄芪-丹参配伍的组合原则及其发挥作用的分子通路仍未得到系统阐明。

目的：本研究旨在系统筛选黄芪-丹参配伍中的生物活性成分，并明确其减轻脑缺血损伤的作用机制。

方法：采用大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠模型评价黄芪-丹参配伍的干预作用。利用UHPLC-HRMS鉴定给药后进入血液和脑组织的相关成分，并构建SSA-BP神经网络预测最优活性成分组合。

采用4D非标记定量蛋白质组学，并结合基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析筛选关键作用通路。通过分子对接和分子动力学模拟验证候选成分与靶蛋白之间的结合特征。

研究通过检测活性氧（ROS）、线粒体膜电位（ΔΨm）、ATP、线粒体呼吸链复合物I活性、Fe²⁺以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG），评价线粒体功能和铁稳态。采用Western blot及免疫荧光检测FUNDC1、Nrf2、SLC7A11、NCOA4、p62、FTH1、UQCRC2和GPX4，并使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）进行机制验证。

细胞实验采用氧糖剥夺/复氧处理HT22细胞，并在复氧期间加入黄芪-丹参提取物。采用CCK-8和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评价细胞活力及细胞毒性，并检测ROS、ΔΨm、Fe²⁺和GSH。OGD/R处理前48小时转染siFUNDC1，用于验证黄芪-丹参作用对FUNDC1的依赖性。

结果：在1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和2∶3五种配伍比例中，黄芪-丹参3∶2配伍的作用最为明显，可改善MCAO小鼠神经功能、缩小脑梗死面积并减轻神经元损伤。

UHPLC-HRMS共确定21种入血成分，其中7种可在脑组织中检出。进一步将黄芪甲苷、黄芪皂苷II、紫草酸、丹参酮IIA和毛蕊异黄酮确定为关键活性成分。SSA-BP神经网络预测的五成分组合在小鼠体内表现出明显的神经保护作用。

蛋白质组学共筛选出124种差异表达蛋白，GO和KEGG分析显示，线粒体自噬和铁死亡是主要富集通路。分子对接及分子动力学模拟显示，黄芪-丹参活性成分可与FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11等靶蛋白形成较高亲和力的结合。

黄芪-丹参配伍上调FUNDC1、UQCRC2、GPX4、SLC7A11、Nrf2和FTH1，并下调p62和NCOA4；自噬抑制剂3-MA可部分逆转这些作用。

在HT22细胞中，黄芪-丹参配伍可提高OGD/R后的细胞活力，减少LDH释放，恢复ΔΨm和GSH水平，并减轻ROS和Fe²⁺积聚。相关蛋白表达变化与动物实验结果一致。敲低FUNDC1可在很大程度上阻断黄芪-丹参配伍的保护作用，证实FUNDC1是其发挥神经保护作用所必需的关键分子。

结论：黄芪-丹参配伍可通过调节线粒体自噬和铁死亡，减轻MCAO诱导的脑缺血损伤，为从现代生物学角度理解益气活血法干预缺血性脑卒中提供了实验依据。

01

研究背景及科学问题

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是一种常见且严重的神经系统疾病，具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点，造成了沉重的全球健康负担。

缺血性脑卒中不仅会引起原发性脑损伤，还可通过能量代谢紊乱、氧化应激、兴奋性毒性和炎症反应等过程加重继发性脑损伤。

重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）溶栓和机械取栓能够改善部分患者的临床结局，但由于治疗时间窗较窄、禁忌证严格，能够接受上述治疗的患者比例仍然有限。因此，寻找更多有效的干预策略仍是缺血性脑卒中研究中的重要问题。

线粒体具有双层膜结构，是细胞能量生成和多种基本生命活动的核心场所。生理状态下，线粒体数量、形态和功能维持相对稳定，这种状态被称为线粒体稳态。

当线粒体功能受损时，细胞能量供应和正常生命活动会受到影响，进而出现线粒体稳态失衡。脑缺血可破坏线粒体结构和功能，引起线粒体肿胀、膜电位下降、能量代谢障碍及细胞死亡通路激活，最终导致神经元损伤。

受损线粒体可通过线粒体自噬（mitophagy）被选择性清除，而正常线粒体成分则参与线粒体新生。脑缺血期间，线粒体分裂、融合和自噬等质量控制过程紊乱，是细胞器功能障碍的重要原因。

线粒体来源的ROS还可催化脂质过氧化并诱发铁死亡。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，主要特征包括脂质氧化损伤、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）耗竭以及ROS过度积聚。

铁死亡受到铁代谢网络和选择性自噬的共同调节。其中，铁蛋白自噬参与细胞铁稳态调节，线粒体自噬则负责维持线粒体完整性。因此，同时调控线粒体自噬和铁死亡、恢复线粒体稳态，可能成为减轻脑缺血损伤的重要研究方向。

中医药在缺血性脑卒中的预防和干预中具有长期应用基础。在中医理论中，“气虚血瘀”被认为是缺血性脑卒中的重要病机，益气活血是相应的主要治法。

“气”与机体生命活动和能量转化有关，而线粒体是现代生物学中的细胞能量中心，因此有研究从能量代谢角度讨论“补气”与改善线粒体功能之间的潜在联系。

既往研究还发现，铁过载程度与血瘀相关评分呈正相关，提示铁过载可能参与血瘀相关病理变化。由此，抑制铁死亡可能是从现代生物学角度研究“活血”作用的一个切入点。

黄芪和丹参常共同用于益气活血类方剂，如黄芪丹参汤、芪参益气滴丸和芪参通络胶囊等。

黄芪中的黄芪甲苷可改善线粒体功能障碍，并通过调节Keap1/Nrf2/HO-1等抗氧化通路抑制铁死亡。毛蕊异黄酮则可通过Nrf2/SLC7A11/GPX4通路减轻铁死亡相关损伤。

丹参中的多种活性成分同样能够调节线粒体功能和铁死亡。丹酚酸B可通过调控线粒体自噬减轻内皮细胞和线粒体功能障碍；丹参酮IIA可通过保护线粒体和促进自噬减轻神经毒性；丹酚酸A则可通过AMPK-PGC1α通路维持线粒体功能稳态。

研究团队此前还发现，丹参素钠可减轻铁死亡、改善线粒体功能障碍，并对脑缺血产生保护作用。

上述研究提示，黄芪-丹参配伍可能通过改善线粒体功能和抑制铁死亡减轻脑缺血损伤。然而，两者在缺血性脑卒中中的最佳配伍比例、关键活性成分及其协同作用机制仍不明确。

因此，本研究建立MCAO小鼠模型，系统考察黄芪-丹参配伍治疗脑缺血再灌注损伤的配伍规律和药理作用，并重点分析其对线粒体功能、线粒体自噬和铁死亡的调控机制。

02

重要发现及亮点

黄芪-丹参3∶2配伍对脑缺血再灌注损伤的改善作用最明显

研究首先比较了黄芪与丹参1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和2∶3五种配伍比例，并以通心络胶囊作为阳性对照。MCAO术后1小时开始灌胃给药，每日1次，连续3天。

与假手术组相比，MCAO模型小鼠出现明显神经功能缺损。黄芪-丹参3∶1、3∶2及2∶3配伍均可降低神经功能缺损评分，并改善胶带去除实验所反映的触觉感知和运动协调能力。

TTC染色显示，MCAO模型组出现明显脑梗死。与模型组相比，黄芪-丹参2∶1、3∶1、3∶2和2∶3配伍均可显著缩小梗死面积。

H&E染色显示，MCAO模型小鼠脑皮质出现明显的细胞核固缩和神经元死亡。黄芪-丹参3∶2配伍可明显减轻上述组织学损伤。综合神经功能、行为学、梗死面积和组织学结果，研究将3∶2确定为后续实验的主要配伍比例。

图1：黄芪-丹参配伍减轻脑缺血再灌注损伤。（A）采用五级评分法评价神经功能。（B）胶带去除实验。（C）脑梗死面积定量分析。（D）具有代表性的TTC染色图像。（E）具有代表性的H&E染色图像。数据以各个独立数值及均值±标准差表示，n=6。QD1：MCAO+黄芪-丹参1∶1组；QD2：MCAO+黄芪-丹参2∶1组；QD3：MCAO+黄芪-丹参3∶1组；QD4：MCAO+黄芪-丹参3∶2组；QD5：MCAO+黄芪-丹参2∶3组；TXL：MCAO+通心络胶囊组。与假手术组相比，***p<0.001；与MCAO组相比，#<0.01，<0.05。

UHPLC-HRMS鉴定黄芪-丹参入血及入脑成分

研究分别对黄芪-丹参颗粒、空白血清、加入黄芪-丹参颗粒的空白血清，以及给药后的含药血清进行UHPLC-HRMS分析，并获得正、负离子模式下的色谱图。

研究通过质谱数据库进行化合物匹配，将质量误差小于25 ppm、碎片离子谱匹配评分大于0.7作为鉴定标准。初步分析获得668个血样相关候选化合物，主要包括生物碱类、萜类、莽草酸及苯丙素类成分。

随后，研究选择相对于空白对照峰强升高至少3倍的正、负离子峰，并按照相对强度排序。在重点分析的35种化合物中，最终确定21种入血成分。

采用相同策略，研究鉴定出7种可在脑组织中检出的成分，包括丹参酮IIA、丹参素、紫草酸、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、黄芪皂苷II和Platyphyllonol。

图2：采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS分析获得的黄芪-丹参配伍基峰色谱图，n=5。（A）血液样本中黄芪-丹参相关成分的正离子模式基峰色谱图。（B）血液样本中黄芪-丹参相关成分的负离子模式基峰色谱图。（C）脑组织样本中黄芪-丹参相关成分的正离子模式基峰色谱图。（D）脑组织样本中黄芪-丹参相关成分的负离子模式基峰色谱图。（E）黄芪-丹参配伍在正离子模式下的基峰色谱图，标记峰强升高至少3倍的成分。（F）黄芪-丹参配伍在负离子模式下的基峰色谱图，标记峰强升高至少3倍的成分。

SSA-BP神经网络筛选并验证五种活性成分组合

考虑到Platyphyllonol并非黄芪或丹参的特征性成分，而丹参素所含邻二羟基酚结构容易氧化、稳定性相对有限，研究将其余5种入脑成分用于神经网络组合筛选。

这5种成分分别为黄芪甲苷、黄芪皂苷II、丹参酮IIA、紫草酸和毛蕊异黄酮。每种成分设置5个剂量水平，共生成3125种候选组合。

SSA-BP神经网络以原始剂量及两两交互项作为输入，以改良神经功能缺损严重程度评分（modified neurological severity score，mNSS）和脑梗死面积为预测结果，并综合考虑疗效与总剂量惩罚。

在469个未参与训练的测试样本中，模型对mNSS预测的决定系数R²为0.8315，平均绝对百分比误差为5.23%；对脑梗死面积预测的R²为0.9045，平均绝对百分比误差为3.85%，表明模型具有较好的预测性能。

模型筛选出的3个候选组合为：

候选组合1：黄芪甲苷40 mg/kg、丹参酮IIA 25 mg/kg、毛蕊异黄酮37.5 mg/kg、黄芪皂苷II 30 mg/kg、紫草酸40 mg/kg。

候选组合2：黄芪甲苷40 mg/kg、丹参酮IIA 25 mg/kg、毛蕊异黄酮37.5 mg/kg、黄芪皂苷II 30 mg/kg、紫草酸50 mg/kg。

候选组合3：黄芪甲苷30 mg/kg、丹参酮IIA 25 mg/kg、毛蕊异黄酮37.5 mg/kg、黄芪皂苷II 30 mg/kg、紫草酸40 mg/kg。

主要脏器和脑组织H&E染色未提示候选组合产生明显组织毒性。进一步的MCAO小鼠实验显示，3个候选组合均可改善神经功能缺损并缩小脑梗死面积，实际体内疗效与模型预测结果之间的偏差约为5%～30%。

图3：SSA-BP神经网络的预测与验证。（A）SSA-BP神经网络预测流程。（B）H&E染色。（C）具有代表性的TTC染色图像。（D）mNSS评分统计结果。（E）脑梗死面积。数据以各个独立数值及均值±标准差表示，n=5。CG1：候选组合1；CG2：候选组合2；CG3：候选组合3。与假手术组相比，***p<0.001；与MCAO组相比，##<0.001。

蛋白质组学将关键作用机制指向线粒体自噬和铁死亡

研究采用4D非标记定量蛋白质组学比较MCAO组和黄芪-丹参干预组脑组织的蛋白表达谱。

本次分析共鉴定出51,608条肽段，其中包括45,880条特异性肽段和5944种蛋白，共有5865种蛋白得到定量。

主成分分析、Pearson相关系数、相对标准差、蛋白丰度及肽段评分等质量控制结果显示，样本质量和实验重复性符合后续分析要求。

以表达倍数大于1.5为上调、低于0.5为下调，同时p<0.05作为筛选标准，共获得124种差异表达蛋白，其中78种上调、46种下调。

GO分析显示，差异蛋白在细胞组分层面主要涉及线粒体外膜、细胞器外膜和外膜结构；在分子功能层面主要涉及鞘脂结合、富含脯氨酸区域结合和磷酸二酯水解酶活性；在生物学过程中主要涉及线粒体解体、线粒体自噬及细胞器解体。

KEGG分析显示，差异蛋白主要富集于多种神经退行性疾病、程序性坏死、脂质与动脉粥样硬化、铁死亡及动物线粒体自噬等通路。研究随后重点考察线粒体自噬和铁死亡。

图4：4D非标记定量蛋白质组学的样本质量分析，n=3。（A）蛋白质鉴定结果。（B）主成分分析（PCA）。（C）Pearson相关系数（PCC）分析。（D）蛋白定量结果的相对标准差（RSD）。（E）蛋白丰度散点图。（F）肽段评分。

图5：124个候选靶点的功能富集分析。（A）差异表达蛋白火山图。（B）表达上调最明显的20种蛋白和表达下调最明显的20种蛋白热图。（C）代表性最高的主要细胞组分。（D）鉴定出的主要分子功能。（E）显著性最高的10项生物学过程。（F）富集程度最高的10条KEGG信号通路。

活性成分与FUNDC1、UQCRC2、GPX4及SLC7A11具有较高预测结合亲和力

研究进一步分析5种活性成分与差异蛋白FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11之间的预测结合能力。所有成分与靶点的结合能均低于−5 kcal/mol，提示可自发形成中等或较强相互作用。

其中，黄芪甲苷、黄芪皂苷II和紫草酸与FUNDC1的结合能力最强；紫草酸、黄芪甲苷和黄芪皂苷II与UQCRC2的结合能力较强；黄芪甲苷、黄芪皂苷II和丹参酮IIA与GPX4的结合能力较强；黄芪甲苷、丹参酮IIA和紫草酸则与SLC7A11表现出较强相互作用。

具体而言，黄芪甲苷与FUNDC1、GPX4和SLC7A11的预测结合能分别为−11.6、−11.9和−8.1 kcal/mol；紫草酸与UQCRC2的预测结合能为−10.2 kcal/mol。

100 ns分子动力学模拟显示，FUNDC1-黄芪甲苷、UQCRC2-紫草酸、GPX4-黄芪甲苷和SLC7A11-黄芪甲苷复合物均可逐渐达到相对稳定状态，并维持一定数量的分子间氢键。

这些计算结果支持相关活性成分与关键蛋白之间可能存在直接相互作用，但分子对接和动力学模拟本身不能替代生物物理结合实验。

图6：分子对接的三维和二维结果。（A）FUNDC1与紫草酸。（B）FUNDC1与黄芪甲苷。（C）FUNDC1与黄芪皂苷II。（D）UQCRC2与紫草酸。（E）UQCRC2与黄芪甲苷。（F）UQCRC2与黄芪皂苷II。（G）GPX4与丹参酮IIA。（H）GPX4与黄芪甲苷。（I）GPX4与黄芪皂苷II。（J）SLC7A11与黄芪甲苷。（K）SLC7A11与紫草酸。（L）SLC7A11与丹参酮IIA。

图7：分子动力学模拟结果。（A）FUNDC1-黄芪甲苷复合物的均方根波动（RMSF）。（B）UQCRC2-紫草酸复合物的RMSF。（C）GPX4-黄芪甲苷复合物的RMSF。（D）SLC7A11-黄芪甲苷复合物的RMSF。（E）FUNDC1-黄芪甲苷复合物的均方根偏差（RMSD）。（F）UQCRC2-紫草酸复合物的RMSD。（G）GPX4-黄芪甲苷复合物的RMSD。（H）SLC7A11-黄芪甲苷复合物的RMSD。（I）FUNDC1-黄芪甲苷复合物的氢键数量。（J）UQCRC2-紫草酸复合物的氢键数量。（K）GPX4-黄芪甲苷复合物的氢键数量。（L）SLC7A11-黄芪甲苷复合物的氢键数量。

黄芪-丹参改善线粒体功能并减轻铁死亡相关改变

透射电子显微镜显示，假手术组神经元线粒体结构基本完整。MCAO组出现线粒体破裂、线粒体嵴减少等明显超微结构损伤。黄芪-丹参干预后，线粒体结构得到改善，并出现嵴结构较清晰的梭形线粒体。

MCAO组脑组织ROS明显升高，而线粒体膜电位、ATP水平及线粒体呼吸链复合物I活性显著下降，提示存在明显线粒体功能障碍。

黄芪-丹参干预降低了ROS水平，同时提高ΔΨm、ATP和复合物I活性，表明其可改善脑缺血再灌注后的线粒体能量代谢和呼吸功能。

铁死亡相关检测显示，MCAO组Fe²⁺和GSSG增加，GSH及GSH/GSSG比值下降。黄芪-丹参可减少异常Fe²⁺积聚，提高GSH水平和GSH/GSSG比值，从而改善细胞抗氧化能力。

图8：黄芪-丹参配伍改善线粒体损伤并抑制铁死亡。（A）各组透射电子显微镜图像，n=3；放大倍数分别为×6000和×20,000，比例尺分别为2 μm和500 nm。（B）ROS水平。（C）线粒体膜电位变化。（D）ATP含量。（E）线粒体呼吸链复合物I活性。（F）Fe²⁺含量。（G）GSH水平。（H）GSSG水平。（I）GSH/GSSG比值。数据以各个独立数值及均值±标准差表示，n=5。与假手术组相比，***p<0.001；与MCAO组相比，##<0.001，#<0.01，<0.05。

黄芪-丹参调节线粒体自噬和铁死亡相关蛋白

免疫荧光结果显示，脑缺血再灌注损伤后，FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11表达均明显下降。黄芪-丹参干预可恢复上述蛋白表达。

FUNDC1是位于线粒体外膜的线粒体自噬受体，可通过LC3相互作用区域募集LC3，促进受损线粒体进入自噬降解过程。UQCRC2是线粒体呼吸链复合物III的核心亚基，与电子传递、ROS生成和线粒体功能密切相关。

Western blot显示，黄芪-丹参提高FUNDC1、UQCRC2及LC3-II/I比值，并降低自噬底物p62，提示受损线粒体清除能力得到恢复。

在铁死亡相关通路中，黄芪-丹参提高GPX4、SLC7A11、核内Nrf2和铁蛋白重链1（FTH1）的表达，同时降低核受体共激活因子4（NCOA4）的表达。

NCOA4是介导铁蛋白自噬的重要受体。其过度活化可促进铁蛋白降解和游离铁释放。黄芪-丹参下调NCOA4、提高FTH1，可能有助于减少铁释放和Fe²⁺积聚。

加入自噬抑制剂3-MA后，黄芪-丹参对FUNDC1、LC3-II/I、UQCRC2、GPX4、SLC7A11、Nrf2、FTH1、p62及NCOA4的调节作用均被部分逆转，提示线粒体自噬参与其抑制铁死亡的过程。

图9：黄芪-丹参配伍提高FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11表达。（A）FUNDC1免疫荧光染色：FUNDC1为红色，HSP60为绿色，DAPI为蓝色。（B）UQCRC2免疫荧光染色：UQCRC2为红色，HSP60为绿色，DAPI为蓝色。（C）GPX4免疫荧光染色：GPX4为红色，NeuN为绿色，DAPI为蓝色。（D）SLC7A11免疫荧光染色：SLC7A11为红色，NeuN为绿色，DAPI为蓝色。比例尺=20 μm。

图10：黄芪-丹参配伍调节线粒体自噬和铁死亡相关蛋白表达。（A）具有代表性的蛋白条带。（B）FUNDC1表达定量。（C）LC3-II/I表达定量。（D）p62表达定量。（E）UQCRC2表达定量。（F）GPX4表达定量。（G）SLC7A11表达定量。（H）FTH1表达定量。（I）NCOA4表达定量。（J）核内Nrf2表达定量。数据以各个独立数值及均值±标准差表示，n=3。与假手术组相比，***p<0.001，*p<0.05；与MCAO组相比，##<0.001，#<0.01；与MCAO+黄芪-丹参组相比，&&&p<0.001，&&p<0.01，&p<0.05。

细胞实验进一步证实黄芪-丹参可恢复线粒体自噬并抑制铁死亡

在正常培养条件下，6.25～200 μg/mL黄芪-丹参提取物未对HT22细胞表现出明显细胞毒性。

OGD/R处理显著降低HT22细胞活力并增加LDH释放。黄芪-丹参在12.5、25和50 μg/mL浓度下可剂量依赖性提高细胞活力并降低LDH释放。

在相同的50 μg/mL浓度下，黄芪-丹参联合处理对细胞活力的改善作用优于单独使用黄芪或丹参，支持两者之间存在协同作用。

黄芪-丹参还可剂量依赖性减少细胞内ROS和Fe²⁺，提高GSH水平及线粒体膜电位，提示线粒体功能得到改善、铁死亡受到抑制。

Western blot结果显示，OGD/R降低FUNDC1、GPX4、SLC7A11和FTH1表达，并提高p62和NCOA4，提示线粒体自噬受损、铁死亡及铁蛋白自噬增强。

黄芪-丹参干预提高FUNDC1、UQCRC2和LC3-II/I，下调p62和NCOA4，同时提高GPX4、SLC7A11、核内Nrf2及FTH1表达。细胞实验结果与动物实验基本一致。

图11：黄芪-丹参配伍通过促进线粒体自噬、抑制铁死亡，保护HT22细胞免受OGD/R损伤。（A）黄芪-丹参配伍在6.25～200 μg/mL浓度下对HT22细胞的细胞毒性。（B、C）CCK-8和LDH实验显示，黄芪-丹参配伍在6.25～200 μg/mL浓度范围内可剂量依赖性提高OGD/R后细胞活力并减少LDH释放。（D）黄芪组、丹参组和黄芪-丹参组的细胞活力，三组给药浓度均为50 μg/mL。（E～I）黄芪-丹参配伍减少ROS和Fe²⁺积聚，提高GSH水平及JC-1检测的线粒体膜电位，比例尺=20 μm。（J～S）Western blot及定量结果显示，黄芪-丹参配伍上调FUNDC1、UQCRC2、LC3-II/I、GPX4、SLC7A11、核内Nrf2和FTH1，并下调p62和NCOA4。数据以均值±标准差表示，功能实验n=6，Western blot实验n=3。与对照组相比，***p<0.001；与OGD/R组相比，##<0.001，#<0.01，<0.05；与OGD/R+黄芪-丹参组相比，&&&p<0.001，&&p<0.01。

FUNDC1是黄芪-丹参恢复线粒体自噬和抑制铁死亡所必需的关键节点

为验证FUNDC1是否介导黄芪-丹参对OGD/R损伤的保护作用，研究在HT22细胞中分别转染FUNDC1小干扰RNA（siFUNDC1）或阴性对照siRNA，再给予OGD/R和50 μg/mL黄芪-丹参处理。

OGD/R降低了细胞活力并提高LDH释放。黄芪-丹参单独处理或联合阴性对照siRNA均可恢复细胞活力、降低LDH释放，说明阴性对照siRNA不会干扰黄芪-丹参的作用。

敲低FUNDC1后，黄芪-丹参对细胞活力及LDH释放的改善作用在很大程度上消失。

Western blot显示，黄芪-丹参可提高FUNDC1、UQCRC2、GPX4和SLC7A11表达，并降低p62和NCOA4。转染siFUNDC1后，黄芪-丹参不再能够有效提高UQCRC2、GPX4和SLC7A11，也无法明显降低p62和NCOA4。

这些结果表明，FUNDC1不仅参与受损线粒体清除，还可能连接线粒体自噬、NCOA4介导的铁蛋白自噬及铁死亡调控。黄芪-丹参恢复FUNDC1介导的线粒体自噬后，可能限制铁蛋白自噬依赖的铁释放，最终减轻铁死亡。

不过，本研究仅在HT22细胞中进行了FUNDC1基因敲低，尚未在FUNDC1敲除小鼠或脑组织特异性敲低模型中完成体内因果验证。

图12：敲低FUNDC1可消除黄芪-丹参配伍对OGD/R损伤的保护作用。（A、B）siFUNDC1可消除黄芪-丹参配伍对细胞活力和LDH释放的保护作用，n=6。与对照组相比，***p<0.001；与OGD/R组相比，##<0.001。（C～I）Western blot及定量结果显示，siFUNDC1可阻断黄芪-丹参配伍诱导的FUNDC1、UQCRC2、SLC7A11和GPX4上调，以及p62和NCOA4下调，n=3。数据以均值±标准差表示。与OGD/R组相比，***p<0.001；ns表示差异无统计学意义。

【贡献】★★★★★

本研究系统考察了黄芪-丹参配伍减轻脑缺血再灌注损伤的配伍规律、活性物质基础及分子机制。

在所比较的五种配伍比例中，黄芪-丹参3∶2配伍在改善神经功能、缩小脑梗死面积和减轻神经元组织学损伤方面表现最为突出。

UHPLC-HRMS共确定21种入血成分和7种入脑成分。研究进一步利用SSA-BP神经网络，从3125种候选配方中筛选出由黄芪甲苷、黄芪皂苷II、丹参酮IIA、紫草酸和毛蕊异黄酮组成的五成分组合，并在MCAO小鼠中验证其神经保护作用。

蛋白质组学、分子对接和分子动力学分析将黄芪-丹参的主要作用指向FUNDC1和UQCRC2相关线粒体自噬，以及Nrf2/SLC7A11/GPX4和NCOA4/FTH1相关铁死亡调控网络。

黄芪-丹参可促进适度的FUNDC1介导线粒体自噬，提高受损线粒体清除能力，恢复线粒体膜电位、ATP生成和呼吸链复合物活性，并减少ROS积聚。

与此同时，黄芪-丹参提高Nrf2、SLC7A11、GPX4和FTH1表达，降低NCOA4及细胞内Fe²⁺水平，可能通过限制铁蛋白自噬依赖的铁释放，减轻脂质过氧化和铁死亡。

自噬抑制剂3-MA可部分削弱上述作用，而敲低FUNDC1则在很大程度上消除了黄芪-丹参对HT22细胞的保护作用，表明FUNDC1介导的线粒体自噬是其协调铁死亡调控的重要环节。

本研究仍存在一定局限。蛋白质组学还发现程序性坏死、炎症等多条富集通路，但研究主要聚焦于线粒体自噬和铁死亡，其他通路的贡献仍需进一步分析。

此外，FUNDC1的因果作用目前主要通过HT22细胞中的siRNA敲低得到验证，未来仍需使用FUNDC1敲除小鼠或脑组织AAV介导的敲低模型进行体内验证。

SSA-BP神经网络筛选出的五成分组合还需要进一步明确最优剂量、药代动力学、脑组织暴露、安全范围及缺血性脑卒中的有效治疗时间窗。

总体而言，本研究表明，黄芪-丹参配伍可通过恢复适度线粒体自噬并抑制铁死亡，减轻实验性脑缺血再灌注损伤，为益气活血类中药配伍的活性成分筛选和现代机制研究提供了新的实验框架。

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