在植物学顶级期刊Molecular Plant、Nature Plants上发表论文，这个实验室总结土壤微生物碳利用效率（CUE）的测量方法以及影响因素

微生物碳利用效率（CUE）是微生物将吸收的碳转化为自身生物量的效率。它是调控土壤有机质动态以及陆地碳通量的关键因素，能使碳从初级生产者流向大气、分解者食物网以及土壤碳库，且微生物碳利用效率与土壤有机碳储量呈正相关。下面，就和小普一起来了解一下吧！

一、CUE的定义及意义

土壤微生物碳利用效率（CUE）：是指微生物将吸收的碳转化为自身生物量的效率。具体而言，CUE反映了微生物在代谢过程中用于自身生长和合成的碳与总吸收碳量之间的比例。通常高CUE意味着微生物将更多的碳用于自身生物量的积累，从而减少碳的损失，有利于土壤有机碳的储存；而低CUE则表明微生物将更多碳用于呼吸作用，导致碳的快速释放，不利于土壤碳的长期储存。CUE不仅影响微生物的生长速率，还对土壤有机碳（SOC）的形成、周转以及温室气体排放具有重要调控作用[1]。

图.微生物代谢成分和平衡方程。

二、影响CUE的因素

影响土壤CUE的因素是多方面的，包括非生物因素（如pH、温度、水分和土壤质地等）和生物因素[1]（如微生物群落结构、微生物多样性和生物量等）。这些因素通过复杂的相互作用影响CUE，从而影响土壤碳循环和生态系统功能。

图.影响微生物CUE的主要因素。

• 温度：温度升高通常会抑制CUE，尤其是在高氮浓度的土壤中。这可能是因为高温促进了微生物的呼吸作用，导致更多碳以CO₂形式释放[2]。

• 水分：短期水分胁迫可能提高CUE，因为微生物在缺水条件下倾向于将碳分配给生长而非呼吸。然而，长期干旱则会降低CUE，因为微生物需要消耗更多能量来维持细胞结构[3]。

• pH值：在pH值接近中性时，CUE较高，而在极端pH值（如强酸性或强碱性）下，CUE较低[3]。

• 土壤养分条件：氮、磷等营养元素的可用性直接影响CUE。当氮或磷受限时，微生物可能无法有效利用碳，导致CUE下降[3]。

• 微生物群落结构：真菌和细菌的比例变化会影响CUE。真菌通常具有更高的CUE，而细菌则倾向于将更多碳用于呼吸[4]。

• 微生物多样性：因不同种类的微生物可以更有效地利用不同类型的碳源，所以微生物多样性较高的土壤通常具有更高的CUE[4]。

• 微生物代谢途径：在厌氧条件下，微生物可能通过发酵或替代电子受体的呼吸作用来利用碳，这可能导致CUE的变化[4]。

• 土壤质地：砂质土壤通常具有较低的CUE，而黏土质土壤则具有较高的CUE，这可能与土壤中有机质的稳定性有关[5]。

• 土壤有机质质量：复杂有机质的分解速率较慢，可能导致CUE较低，而简单有机质的分解速率较快，可能导致CUE较高[1]。

还有研究表明，微生物CUE对多数全球变化因子表现出较强弹性，仅土地利用转换和N、P、K配施显著改变CUE。土壤pH是调控CUE的关键环境因子，而CUE与SOC的关系因场景而异，需结合碳同化与稳定的双重机制解析。这些因素之间的相互作用和复杂性使得理解土壤微生物CUE的变化机制仍然具有挑战性。未来的研究需要进一步探讨这些因素的综合影响，以更好地预测和管理土壤碳循环[3]。

三、CUE的测量方法

土壤微生物CUE通常表示为微生物生长与吸收的比率，根据微生物生长速率、微生物生物量、底物吸收率以及底物浓度变化等因素被划分为不同的方法，变异范围在0.2至0.8之间。热力学、生态环境因素、底物养分质量和可获得性、化学计量平衡以及微生物群落组成都会影响这种变异[1]。下面是五种常用CUE测量方法的介绍与比较。

（1）18O标记水培养法

18O标记水培养法是一种用于测定土壤微生物碳利用效率（CUE）的常用方法，其基本原理是通过标记水中的18O掺入微生物细胞基因组DNA来确定微生物的生长速率，进而计算CUE[3,6]。这种方法假设用于微生物DNA合成的氧全部来自于添加的胞外水，但微生物也可能利用由氧气（O₂）合成的代谢水中的氧。一项研究表明，新形成的微生物DNA中只有0.75%的氧元素来自被标记的O₂；99.25%来自添加的H₂O。因此，该方法具有较高的准确性。需要注意，在干燥土壤中外源添加水会导致‘Birch’效应（脉冲效应）（干旱土壤重新湿润后，土壤中二氧化碳（CO₂）排放量出现短暂而显著增加的现象），但可以通过 18 O 水的蒸汽法降低干燥土壤的实验误差。

其方法示意图如下所示：

图.18O标记水培养法示意图。

其计算公式如下：

式中：DNAp表示微生物DNA产量，μg/g；Ot为干燥DNA提取物中的总氧含量，μg/g；at%e为标记样品的18O at%（18O丰度）与非标记样品的18Oat%（18O天然丰度）之间的差异；at%swr为土壤水的18O丰度；31.21为DNA中氧气的平均百分比；C/DNA为微生物生物量碳含量（μg/g）与DNA含量（μg/g）的比值；CO2为微生物呼吸的碳通量μg/g。

（2）13C底物标记法

13C底物标记法是测定CUE的常用方法之一，其基本原理是通过向土壤中添加含有13C标记的有机底物（如葡萄糖、香兰素等），监测微生物对这些底物的吸收和矿化过程，从而计算出微生物将碳源转化为自身生物量碳的比例[2]。这种方法能够直接反映微生物在短期内的碳代谢活动，但其结果可能受到多种因素的影响，例如底物类型、浓度、培养时间以及微生物群落的组成等。

其计算公式如下：

CUE13C=[13CMB/（13CMB+13CO2）]

式中：13CMB表示纳入微生物生物量的13C含量，μg/g；13CO2表示微生物群落呼吸累积释放的13C含量，单位同上。

13 C底物标记法存在一定局限性： 13 C 标记的底物加入土壤中会引起微生物活动的激发效应，增强微生物群落的呼吸作用，从而高估CUE。底物浓度通常高于实际土壤条件，可能引起周转率较快的r策略微生物生长，而生长缓慢的k策略微生物可能无足够时间获取底物。且微生物量碳采用“氯仿熏蒸法”测定，该法测定的是微生物细胞中所有的碳，混淆了分配给微生物生长的碳，会导致高估CUE。因此，选用此方法需要对培养时间和培养底物进行标准化。

（3）热呼吸法

热呼吸法测定CUE，其核心原理是通过测量微生物在代谢过程中释放的热量与呼吸速率之间的关系来估算CUE[3,6]。其测定是在一定实验条件下，通过测量微生物在代谢过程中释放的热量与CO₂释放量的比值（CR），并结合底物的氧化状态和微生物生长情况，估算微生物将碳用于生长的比例。

其计算公式如下：

式中：Rq：热量产生量；RCO2：呼吸量；469：是水相葡萄糖燃烧的氧卡路里当量（KJ/mol）；γs：底物碳的氧化态（一般是葡萄糖=0）；γMB：微生物生物量碳的氧化态（一般为=-0.3）；115：底物转化为微生物生物量过程中碳氧化态变化的平均能量损失（KJ）。

热呼吸法存在一定的局限性，R q /R CO2 的范围在250-469KJ/mol碳之间，因此，该方法只限在氧化条件下进行，在厌氧或者发酵等情况下，不能使用该方法。且需要了解不同底物碳的氧化态、微生物量碳的氧化态以及高精度的量热仪等。

（4）底物吸收法

底物吸收法的原理是通过培养过程中底物消耗的浓度及累计呼吸碳量来估算CUE[3,6]。其测定是将土壤样品与底物混合后进行短期的室内培养，通过测定培养过程中底物浓度的变化，计算微生物的吸收速率；同时测定微生物的呼吸量，即CO₂的释放量。来估算CUE。

其计算公式如下：

式中：v1：表示葡萄糖-C的吸收率；∑CO 2 ：表示由丙酮酸脱氢酶、葡萄糖酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶等酶控制的反应中所有以CO 2 形式损失的C总量。

该方法是假设底物的代谢等于土壤有机质的代谢，但土壤有机质的代谢会低于底物的代谢，会存在高估CUE的情况，且结果易受底物类型的影响。

（5）化学计量学模型估算法

化学计量学模型法是一种用于估算CUE的间接方法，其核心在于通过微生物的化学元素组成（如碳、氮、磷的比例）和胞外酶活性来推断微生物对碳资源的利用效率[7]。

其计算公式如下：

式中：BC∶X：为微生物生物量碳与氮或磷的比值；LC∶X：是易降解碳与氮或磷的比值，一般为DOC、DON；EEAC∶X：表示与碳氮或磷相关的酶活性之比；基于热力学约束，CUEmax为0.6；KX：是半饱和参数，为0.5；常用的指示酶有：与C有关的（BG酶），与N有关的（LAP酶+NAG酶），与P有关的（AP酶）。

CUE是通过土壤有机质全库计算的，该法只计算了土壤有机质中的部分库，存在误差；热力学限制下，假设的CUE最大值为0.6，相较于其他方法，该法计算的CUE可能偏小，且公式中的一些经验系数包含较大的不确定性。

四、文献分享

氧气来源的氧不会影响18O标记水法测定微生物碳利用效率的准确性

期刊名称：Soil Biology and Biochemistry

影响因子：9.8

DOI：https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2022.108649

1.研究内容

18 O标记水培养法是当前广泛用于估算土壤微生物碳利用效率（CUE）的最新方法。该方法假设微生物DNA合成所需的氧完全来源于培养介质中的水。然而，氧气（O 2 ）是否可能作为氧源尚不清楚。本研究遵循土壤微生物CUE测量的标准流程，比较了 18 O 标记水和 18 O 标记O 2 培养实验的结果。结果表明，在48小时培养后，新合成的微生物DNA中99.25%的氧原子来源于施加的水，而0.75%的氧原子来源于O 2 。研究表明，在短期培养期间，O 2 对微生物DNA合成的贡献可以忽略不计，并且对于所测试的森林土壤， 18 O 标记水法在估算土壤微生物CUE方面是可靠的。

2.研究结果

微生物碳利用效率（CUE）目前被广泛用于评估微生物代谢，是碳循环模型中的一个重要参数。微生物CUE指的是新形成的微生物生物量碳与微生物吸收的总碳量之比。最近，18O标记水方法被用于其估算，因为一项比较分析表明，与其他可用方法相比，该方法最可靠且变异最小。该方法的前提是微生物DNA合成中所用的氧完全来源于所施加的水（图1d）。然而，其他来源的氧也可能参与微生物DNA的合成，这可能使该前提不成立，并导致微生物CUE估算的不确定性。最近一项研究发现，在微生物DNA合成中，来源于水的氧与来源于葡萄糖的氧的比例为9:1。由于葡萄糖是土壤有机碳（SOC）中最不稳定的形式，该研究表明在CUE测量实验中，SOC中的氧原子对微生物DNA合成中氧的贡献应该非常低。然而，除了SOC和细胞外水，微生物也可能利用代谢水来合成DNA（图1b）。微生物细胞持续进行着各种代谢过程，某些代谢途径会产生新的水，称为代谢水。产生代谢水的一个重要过程是有氧呼吸，这是一种生物氧化作用。在此过程中，O₂在线粒体内膜上作为电子受体，与活化的氢结合，在细胞内形成代谢水（图1a）。先前研究发现，在微生物细胞活跃生长期间，代谢水可占细胞内水的70%，尽管这个比例在稳定期或静止期细胞中要低得多。迄今为止，代谢水是否可能参与微生物DNA合成中的氧供应仍不清楚。最近一项研究基于数学模型提出，假设DNA合成中的氧有30%来源于细胞外水以外的其他来源，那么18O-H₂O方法会低估CUE。在此，我们采用18O标记的O₂和18O标记的H₂O，在48小时培养期间测定它们对微生物DNA合成中氧的贡献，以评估18O标记水方法测量微生物CUE的准确性。

图1.微生物DNA合成中氧原子潜在来源的示意图解显示，细胞内结构经简化处理，仅呈现DNA与水分子。氧气参与的有氧呼吸作用（a）及其他代谢过程（f）产生代谢水，该代谢水可能被用于DNA合成（b）。代谢水亦可外排至细胞外（c），或与其他氧阴离子发生氧同位素交换（e）。若代谢水扩散至胞外，其同位素信号将被胞外水稀释；已有研究发现胞外水参与微生物DNA合成（d）。本研究旨在验证途径a→b的通量是否显著高于途径d。若存在显著通量，则当前基于18O标记胞外水的微生物碳利用效率测定方法需重新评估以提高准确性；若通量不显著，则表明途径c、e、f可能是尚未明确的重要代谢通量，需开展深入研究。

本研究采集中国长白山温带森林土壤样品（详见表S1）。样品经实验室过筛（<2mm）后，调节至最大持水量的50%，于15℃预培养7天。预培养结束后，称取64份1克土壤分样置于2毫升螺口瓶中（16种处理×4重复，见表S2）。将半数样品添加100μL 18O标记水（5、10、20、30、40、50、60原子百分比梯度），另半数添加等量非标记水。所有样品瓶置于1升广口瓶中，以40mL/min流速通入氮气40分钟（经预实验氧浓度检测验证可完全置换氧气）。随后向非标记水组注入210mL梯度18O标记氧气（5、10、20、30、40、50、60原子百分比），向18O标记水组注入等量非标记氧气，使瓶顶空气氧浓度达21%（v/v），并设置非标记水/氧对照组。根据前期优化的培养时间，样品于15℃培养48小时。培养结束后经冷冻干燥处理，采用MoBio PowerSoil DNA提取试剂盒获取DNA，最终通过高温裂解元素分析仪-同位素比值质谱联用系统（IRMS-TC/EA）测定总氧含量及18O丰度。

表S1.本研究采样点信息及土壤性质（0-5cm土层，均值±标准误，n=4）。

注：土壤碳氮比（Soil C/N ratio，即土壤有机碳与全氮量之比）、土壤氮磷比（Soil N/P ratio，即全氮量与全磷量之比）、微生物生物量碳—氮比（MBC/MBN，即微生物生物量碳与微生物生物量氮之比）以及微生物生物量氮—磷比（MBN/MBP，即微生物生物量氮与微生物生物量磷之比）是本研究的核心计量参数。

表S2.呈现了本研究的实验设计方案。

本研究采用以下方程定量解析培养期间微生物DNA合成过程中水分子与氧气对氧原子的相对贡献率：

基于标记实验获取的DNA18O原子超量值（y1表示18O-H₂O处理组，y2表示18O-O₂处理组）与环境基质18O丰度（x1：土壤水相，x2：气相O₂），结合DNA合成速率b（ng DNA·g⁻¹干土·h⁻¹）及培养时间t（0–48h边界条件：t=0时，APE-18ODNA=0；t=48时APE-18ODNA=OT×y）。其中总氧含量OT依据DNA分子式（C₃₉H₄₄O₂₄N₁₅P₄）理论氧质量分数31.2%计算；最终通过胞外水来源氧与O₂来源氧的比值1：a，因此，H2O来源氧与O2来源氧对新合成微生物DNA的相对贡献率分别计算为（1/（1+a））和（a/（1+a））。

微生物DNA的18O原子超量值（APE-18O）与添加水相及氧气的18O原子超量值呈显著正相关（表1，图S1），其回归斜率分别为0.0016（水相）和0.000012（氧气）。定量解析表明：新合成微生物DNA中99.25%的氧原子来源于胞外水，仅0.75%来源于氧气。本评估未考虑土壤有机碳来源氧的贡献，因既往研究证实SOC衍生氧对DNA合成的贡献率极低。基于氧气对微生物DNA合成的微弱贡献（<1%），18O标记水法评估受试森林土壤微生物碳利用效率具有可靠性。

表1.呈现了添加示踪剂后15℃培养48小时条件下，土壤微生物DNA中18O原子超量值（APE-18O，%）与土壤水相或气相氧气APE-18O的回归统计参数。

图S1.呈现了15℃培养48小时后，土壤微生物DNA中18O原子超量值（APE-18O，%）与土壤水相（a）或氧气（b）APE-18O的函数关系。数据点以均值±标准误表示。

本研究证实：培养期内氧气对微生物DNA氧原子的贡献率微乎其微，其根本机制在于代谢水在细胞内DNA合成水相中占比极低。尽管纯培养研究曾报道代谢水对微生物生长的显著氧贡献，但此类结论源于单菌株最优培养体系，与土壤整体培养环境存在本质差异。如体系复杂性差异：纯培养采用单一菌种最适条件，而土壤微生物群落具高度多样性且受营养盐-温度-水分等自然条件制约，其中休眠态微生物占主导（>80%活细胞），且不同类群代谢水利用模式存在显著分异；生长策略差异：纯培养菌株多为r-策略者（倍增时间<2h），而土壤微生物群落以k-策略者为主（倍增时间>50h），其代谢活性较实验室体系降低1-2数量级。基于细胞质水自由跨膜扩散的特性（图1c），同位素标记代谢水在土壤中发生快速外排效应。以球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）为例，其氧化酶催化反应产生的水分子约78%释放至周质空间并外排至胞外，与胞外水达成同位素平衡。因代谢水日产量（<0.5μmol·g⁻¹干土）不足胞外水总量（>500μmol·g⁻¹干土）的千分之一，一旦扩散至胞外，其同位素信号即被指数级稀释（稀释因子>10³），导致18O-O₂处理组DNA的18O原子超量值始终低于检测限（<0.005atom%）。

氧气在代谢水与其他氧含物（如CO₃²⁻、PO₄³⁻和NO₃⁻）之间的交换也可能稀释了代谢水的18O信号（图1e）。例如，尽管呼吸作用产生的CO₂中的氧来源于土壤有机碳（SOC），但其在碳酸酐酶的催化下会迅速与水中的氧发生交换。此外，水也被发现与亚硝酸盐发生氧原子交换，尽管其通量可能不高。或者，O₂可能对代谢水的贡献并不显著。细胞组分的分解和生物合成、外部营养物质的降解和转化也可能产生代谢水。然而，这些过程目前仍不完全清楚，未来的研究需要进一步阐明这些复杂的过程。尽管如此，我们的研究表明，在48小时的土壤培养后，O₂衍生的氧对新合成DNA的贡献低于1%，而18O标记水的方法对于评估所测试森林土壤的微生物碳利用效率（CUE）是可靠的。这一建议并不一定适用于其他类型的土壤，因为不同土壤的性质和微生物群落存在差异。未来的研究需要在其他类型的土壤中验证本研究的发现。

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参考文献：

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[4] 陈智, 于贵瑞. 土壤微生物碳素利用效率研究进展[J]. 生态学报, 2020, 40(3): 756-767.

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