Nat Cell Biol | 单细胞与空间转录组绘制人小肠间充质细胞图谱

撰文| 阿童木

小肠具有精确的组织结构，从实现营养吸收的隐窝—绒毛轴，到与肠神经系统（ENS）协同完成蠕动的肌层，这些结构对其功能至关重要。此前，人们已广泛运 用单细胞技术研究成人和发育中人类肠道的细胞异质性，以探讨其发育、稳态与疾病 （详见BioArt报道： ； ； ） 。对 于肠上皮、肌层和肠神经系统而言，绒毛形态发生和细胞组成等组织尺度特征已有较为充分的认识；相比之下，源自中胚层的间充质细胞，尤其是成纤维细胞群体，仍然缺乏清晰界定。

过去，这些细胞经常被统称为成纤维细胞或肌成纤维细胞。近年来的单细胞RNA测序研究显示，肠道成纤维细胞并不是均一群体，而是包含多个具有不同转录特征的亚群【1,2】。然而，组织解离会破坏细胞原有的位置关系。仅凭单细胞转录组，很难确定一个亚群究竟紧贴上皮，位于绒毛核心，还是分布在黏膜下层。与小鼠相比，人小肠发育过程中成纤维细胞的空间组织尤其缺乏系统描述。

近日， 密歇根大学Jason R. Spence团队 等 在 Nature Cell Biology 在线 发表 了题为 Mapping mesenchymal diversity in the human small intestine and organoids 的研究文章 。 研究整合单细胞RNA测序与Xenium空间转录组，绘制人胎儿小肠间充质图谱，定义四类空间分区明确的成纤维细胞，并以此评估移植人肠类器官，发现EREG条件生成的类器官在部分细胞成熟标志和空间组织特征上更接近较晚期胎儿小肠。

作者首先整合已有的人胎儿小肠单细胞RNA测序数据，根据主要细胞类型、成纤维细胞标志物以及部分信号和结构相关基因，设计了一个包含292个基因的Xenium探针面板。 随后，研究人员对7例处于受孕后54—142天的人胎儿肠道样本进行Xenium成像，后续分析聚焦十二指肠、空肠和回肠等小肠区域，共纳入475,698个具有空间坐标的细胞。

Xenium数据识别出上皮、成纤维细胞、平滑肌、内皮、免疫细胞和肠神经系统等主要细胞类别。与组织解离后的单细胞测序相比，空间转录组保留了隐窝、绒毛、黏膜肌层、黏膜下层和固有肌层之间的组织关系。两种方法得到的细胞比例存在一定差异，例如Xenium数据中的上皮细胞比例较高，而单细胞测序中免疫细胞相对富集，提示组织解离和切片平面都会影响细胞组成的估计。

在进一步分析成纤维细胞时，作者排除了平滑肌细胞、周细胞、增殖细胞和Cajal间质细胞，由此分辨出 四类非平滑肌成纤维细胞 。它们不仅具有不同的标志基因，也分别占据较为固定的解剖位置。

第一类是上皮下细胞，即SEC 。这些细胞高表达PDGFRA和F3，在整个隐窝—绒毛轴上紧贴上皮，形成连续的单细胞层。SEC在54天样本中已经出现，提示上皮下间充质层在胎儿小肠发育早期便已建立。FISH实验进一步验证了F3阳性细胞位于上皮正下方。

第二类是固有层成纤维细胞，即LPF 。它们位于SEC层以内的绒毛核心， 从绒毛基部和隐窝周围区域延伸至绒毛顶端。 LPF的标志物随发育阶段发生变化。 早期LPF主要表达FABP5，而ADAMDEC1表达较低；从受孕后80天开始，部分LPF共同表达FABP5和ADAMDEC1。此后，FABP5表达逐渐降低，ADAMDEC1成为更主要的标志物，GPX3和ALDH1A3等标志物也在较晚阶段出现。 拟时序分析也呈现出由FABP5高表达状态向ADAMDEC1高表达状态变化的轨迹。 该结果提示LPF会随组织发育发生阶段性的转录状态变化，但由于研究没有进行谱系追踪，尚不能据此确认不同状态之间的直接谱系关系。

第三类是黏膜下成纤维细胞，即SMF 。这些细胞表达SHISA3、FIBIN和C1QTNF3，其中SHISA3在不同发育阶段均表现出较稳定的特异性。SMF位于黏膜肌层与固有肌层之间。早期阶段，这些细胞形成较为松散的多细胞层；随着黏膜肌层出现和组织增厚，SMF持续填充黏膜下区域。

第四类是数量较少的CXCL13 + 成纤维细胞 。 该群体主要在较晚发育阶段出现，分布于绒毛基部—隐窝上部区域、SEC层内或附近、绒毛中部以及Peyer集合淋巴结区域。 CXCL13与淋巴组织形成有关，既往研究也提示这类细胞可能与免疫细胞发生信号交流。不过，本文主要确定了它们的分子身份和空间位置，其在人小肠淋巴组织发育中的具体作用仍需功能实验验证。

由于292基因面板的转录组深度有限，作者进一步使用CytoSPACE，将受孕后122—132天胎儿小肠的单细胞RNA测序数据映射到142天样本的Xenium空间图谱中，并将匹配细胞的全转录组表达谱插补至相应的空间细胞。作者随后利用CellChat推测细胞间的EGF、Hedgehog和WNT信号。分析预测， 肠干细胞和吸收细胞可能是EGF及Hedgehog信号的重要来源，而包括黏膜肌层平滑肌细胞在内的多类细胞可能参与WNT信号交流 。这些结果展示了空间图谱与单细胞数据联合分析的潜力，但相关表达谱和配体—受体关系均属于计算推断，仍需进一步实验验证。

在建立胎儿小肠图谱后，作者将其用于评价人肠类器官。研究比较了以EGF或EREG培养、随后移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下的人肠类器官。移植后，两类类器官均形成隐窝—绒毛样上皮结构，并出现固有层、黏膜肌层、黏膜下区域、固有肌层、内皮细胞和肠神经系统。SEC、LPF和SMF也按照与人组织相似的顺序排列：SEC紧贴上皮，LPF位于绒毛核心，SMF位于黏膜肌层和外侧肌层之间。

不过，细胞类型相似并不意味着发育状态完全一致。EGF类器官中的LPF更多保持FABP5 + 、ADAMDEC1 - 的较早期状态，其上皮也保留F3表达，类似较早阶段的胎儿组织。相比之下，EREG类器官中ADAMDEC1 + LPF比例较高，细胞之间的空间距离也更接近105天以后的胎儿小肠。两类类器官均未检测到CXCL13阳性成纤维细胞，这可能与类器官缺少人源免疫细胞以及整体发育尚不充分有关。

研究还分析了一例成人十二指肠。胎儿期定义的四类成纤维细胞在成人组织中仍可识别，其基本位置也得到保留，但细胞比例发生变化。LPF在成人成纤维细胞中占据主要部分，而胎儿期比例较高的SMF明显减少，并在成人黏膜下层中呈较为疏散的分布。这表明， 人小肠成纤维细胞的基本空间分区能够延续至成年，但各亚群的相对丰度和组织方式会随发育改变 。

这项研究的主要价值，是 为人小肠成纤维细胞建立了一套同时包含分子标志、解剖位置和发育阶段的分类框架 。研究也提示， 评价类器官是否接近真实组织，不能只统计其包含哪些细胞，还需要考察这些细胞是否位于正确位置，以及是否具有与目标发育阶段相符的表达状态。

不过，这一图谱仍有一定限制。292基因面板可能遗漏未预先选择的细胞状态，各发育阶段样本并非严格的生物学重复，成人组织及两种类器官也分别只有一例。此外，空间映射和细胞通信分析主要用于生成假设，并未直接证明相关细胞亚群或信号通路的功能。尽管如此，该研究仍为理解人小肠间充质结构、比较不同类器官培养体系，以及进一步改进组织工程模型提供了可用于定量评价的空间参照。

https://doi.org/10.1038/s41556-026-02027-2

制版人： 十一

参考文献

1. McCarthy, N., Kraiczy, J. & Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche.Nat. Cell Biol. 22, 1033–1041 (2020).

2. McCarthy, N. et al. Smooth muscle contributes to the development and function of a layered intestinal stem cell niche.Dev. Cell58, 550–564 e556 (2023).

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