中国药科大学Angew：会“发光”的天然绿原酸水凝胶，为脑癌术后“边治边看”提供全新方案

胶质母细胞瘤（GBM）作为一种深部恶性脑肿瘤，具有极高的复发率和独特的肿瘤微环境（TME）。目前，临床常规治疗手段主要依赖手术切除肉眼可见的肿瘤组织，并辅以化疗或放疗，但面对GBM高度浸润性的特点，这些方法往往难以根除残余病灶，导致术后复发风险居高不下。在肿瘤诊疗领域，荧光成像技术虽被广泛应用，但其依赖实时激发，易受组织自发荧光背景干扰，导致信噪比低下，尤其难以满足深部肿瘤长期、无创监测的需求。近年来，余辉发光技术因其在激发停止后仍能持续发射信号，有效规避生物背景噪声，成为提升成像对比度的前沿方向。然而，现有余辉探针多局限于半导体聚合物纳米颗粒或合成有机分子，尚未有基于天然产物且以水凝胶形式存在的余辉体系见诸报道。因此，开发兼具优良生物安全性、深层组织穿透能力以及治疗监测功能的新型余辉材料，对于改善GBM术后管理具有迫切的临床意义。

针对上述挑战，中国药科大学蔡挺教授、彭亚运副研究员团队首次发现天然抗肿瘤活性成分绿原酸（CA）具有独特的声致余辉特性。基于此，研究者设计了一种对过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）特异性响应的CA前药（Pro-CA），该前药可在弱碱性水溶液中自组装形成超分子水凝胶（Pro-CA Gel），并负载声敏剂维替泊芬（VP），构建了VP@Pro-CA Gel制剂。该体系在术后局部注射后，可通过声动力治疗（SDT）杀伤残余肿瘤细胞，同时利用CA固有的免疫调节活性促进M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化，激活抗肿瘤免疫。尤为关键的是，该水凝胶能够响应肿瘤微环境中升高的ONOO⁻，产生ONOO⁻触发的声致余辉发光，实现实时治疗监测。这一研究不仅首次揭示了天然小分子作为高效、安全的声致余辉底物的潜力，也为GBM术后“治疗-监测”一体化闭环管理提供了全新范式。相关论文以“In Situ Sonoafterglow Supramolecular Hydrogel From Natural Substrate for Post-Surgical Glioblastoma Treatment”为题，发表Angewandte Chemie International Edition上。

发现与机制：天然苯丙素类产物的声致余辉现象及其原理

研究团队首先筛选了多种结构独特的苯丙素类天然产物作为候选声致余辉底物（图1a），并与经典声敏剂联用进行超声激发实验（图1b）。结果表明，含有绿原酸和咖啡酸的实验组在超声辐照后产生了显著的声致余辉信号，而其余候选物则无明显现象（图1c）。进一步统计分析证实，在同等浓度条件下，绿原酸和咖啡酸与声敏剂联用并经充分超声激发后，均可产生稳健的余辉发光（图1d）。由于绿原酸具有更优越的抗肿瘤活性，研究者选择其作为后续研究对象。光谱分析显示，绿原酸的荧光发射峰（约400–600 nm）与声敏剂VP的吸收波段（400–500 nm及500–600 nm）具有良好的光谱重叠，满足化学发光共振能量转移的必要条件。值得注意的是，咖啡酸的声致余辉强度高于绿原酸，而奎宁酸则无余辉效应，提示绿原酸的余辉活性可能源于其酯键断裂后释放的咖啡酸结构。质谱与核磁共振分析进一步鉴定出，在单线态氧（¹O₂）作用下，绿原酸与咖啡酸均生成共同的氧化产物——咖啡酸二氧杂环丁烷衍生物（分子量236.02）。基于此，团队提出了绿原酸的声致余辉机制（图1e）：超声激活的声敏剂持续产生¹O₂等强氧化剂，绿原酸优先发生酯键断裂生成咖啡酸中间体，其中C=C双键被进一步氧化为不稳定的二氧杂环丁烷中间体，经开环氧化形成高能态的绿原酸醛，后者通过化学发光共振能量转移将光子能量转移给VP，从而产生持续的长波长余辉信号。在液相体系中，CA+VP混合液经超声激发后，其余辉发射光谱与VP的荧光光谱高度吻合（峰值约700 nm）（图1f），余辉强度随超声时间延长而增强（图1g、1h），且在超声停止后可维持约3分钟（半衰期约100秒），具备体内外成像应用的理想时长（图1i）。

图1.天然底物声致余辉现象的发现及其机制。（a）基于天然苯丙素类药物的声致余辉底物；（b）基于卟啉的声致余辉引发剂；（c）苯丙素类天然药物作为声致余辉底物的余辉效果筛选结果（I. 肉桂酸，II. 阿魏酸，III. 咖啡酸，IV. 绿原酸，V. 芥子酸，VI. 异甘草素，40 mM，声敏剂=40 μM，超声设置：1.0 MHz、100 Hz、2.0 W·cm⁻²、60秒，V=200 μL，采集时间：5秒）；（d）绿原酸和咖啡酸（两者均表现出作为声致余辉底物的潜力）与超声敏感引发剂联用的余辉强度统计分析；（e）基于绿原酸的声致余辉分子机制分析示意图；（f）CA+ONOO⁻+VP体系在不同发射波长下的声致余辉光谱采集（CA=50 mM，VP=20 μM，US：2.0 W·cm⁻²，30秒，采集时间：5秒）；（g）CA+ONOO⁻+VP（CA=50 mM，VP=20 μM，ONOO⁻=100 μM，V=300 μL）在不同激发时间下的超声诱导发光图像（2.0 W·cm⁻²，5–120秒，采集时间：5秒）；（h）声致余辉强度随超声时间增强的统计图；（i）CA+ONOO⁻+VP的声致余辉衰减曲线（超声时间：30秒，采集时间：5秒）。

前药设计与特异性响应：ONOO⁻触发的智能余辉激活

为实现肿瘤微环境特异性响应，研究者对绿原酸进行了化学修饰，合成了前药Pro-CA（分子量1091.37）。该前药通过酯键将苯丙氨酸结构连接至绿原酸，使其酯键的断裂需要强氧化剂ONOO⁻的特异性参与（图2a）。高效液相色谱分析显示，加入ONOO⁻后出现新的色谱峰，证实酯键断裂及活性中间体的生成；而¹O₂处理则未引起明显变化，表明Pro-CA对ONOO⁻具有高度选择性。紫外-可见光谱进一步显示，Pro-CA在加入ONOO⁻后溶液颜色发生明显改变并出现光谱红移（图2b），与绿原酸的行为一致。在余辉性能方面，Pro-CA+VP体系仅在ONOO⁻存在时才产生显著的声致余辉信号（图2c），且余辉强度与ONOO⁻浓度呈正相关；加入ONOO⁻清除剂NAC后，余辉强度显著下降，溶液颜色几乎恢复至初始状态。特异性实验还表明，该体系对其他多种活性氧物种和金属离子均无明显响应（图2d），充分证实了Pro-CA的ONOO⁻特异性响应特性。

图2.Pro-CA体系的合成、性质及应用设计。（a）Pro-CA化学修饰过程及其对ONOO⁻特异性响应的示意图；（b）Pro-CA在加入ONOO⁻前后的紫外-可见光谱分析（插图：Pro-CA溶液在ONOO⁻处理前后的颜色变化）；（c）Pro-CA+VP±ONOO⁻体系在不同发射波长下的声致余辉光谱采集（CA=50 mM，VP=20 μM，US：2.0 W·cm⁻²，30秒，采集时间：5秒）；（d）Pro-CA（50 mM）与不同RONS（100 μM）或金属离子（100 μM）孵育后的声致余辉增强效果；（e）Pro-CA与VP自组装形成纳米纤维状超分子凝胶VP@Pro-CA Gel的示意图；（f）采用原位注射VP@Pro-CA Gel至GBM小鼠术后腔隙进行复发预防的SDT整合诊疗策略示意图。

超分子水凝胶的构建与理化性质表征

更为重要的是，Pro-CA在弱碱性水溶液（1% NaHCO₃，55℃）中可自发自组装形成超分子水凝胶Pro-CA Gel，其载药率高达99.93%（图2e）。该凝胶具备良好的可注射性和塑性，能够通过注射器轻松注入术后腔隙并原位成型（图3a、3b）。扫描电镜观察显示，Pro-CA Gel具有规整致密的三维网络结构，由相互交织的纳米纤维构成，且孔径随浓度增大而减小（图3c）。倒置显微镜实时监测凝胶形成过程表明，凝胶的形成主要依赖于Pro-CA从碳酸氢钠水溶液中沉淀后的逐渐生长，最终形成三维网络结构（图3d）。原子力显微镜进一步揭示，在极低浓度（0.02%）下，Pro-CA首先形成纳米柱状颗粒；随着浓度升高至0.1%和1%，颗粒逐渐生长、伸长并交织成纤维网络，最终形成自支撑的超分子水凝胶（图3e）。流变学测试证实，在2%浓度下，凝胶的储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），表明其固体形态在该应力范围内保持稳定（图3f）；频率扫描中二者呈平行同步增长，符合典型凝胶的流变特征（图3g）；其屈服应力仅为37.49 Pa，表明材料质地柔软、易于变形。体外释放实验显示，Pro-CA Gel在人工脑脊液中可持续降解并缓慢释放Pro-CA，完全释放时间超过96小时（图3h）。释放液中的纳米纤维平均粒径约274.3 nm（图3i）。红外光谱表明，凝胶化过程中O─H氢键吸收峰（3430 cm⁻¹）及C═O峰位（从1705 cm⁻¹移至1655 cm⁻¹）发生明显位移（图3j），提示氢键和π-π堆积作用参与自组装；X射线衍射则显示冻干后的Pro-CA Gel无特征结晶峰（图3k），偏振光显微镜下亦未见明显晶体残留，说明其形成过程为无定形颗粒的沉淀与生长。

图3.Pro-CA Gel的理化性质、体外性能及形成机制研究。（a）Pro-CA水凝胶的温度响应可逆凝胶-溶胶转变；（b）Pro-CA Gel的可注射性和可塑性；（c）Pro-CA Gel（2% w/t）的代表性SEM图像，比例尺：10 μm；（d）倒置显微镜观察Pro-CA Gel的形成过程，时间点：0、5、10、15和20秒；（e）不同质量浓度（0.02%、0.1%和1% w/t）下Pro-CA凝胶的AFM观察结构特征；（f）Pro-CA Gel的流变学线性黏弹性区域分析；（g）Pro-CA Gel的流变学频率扫描；（h）Pro-CA Gel在人工脑脊液中的体外释放曲线；（i）Pro-CA Gel降解释放液10分钟后的粒径分析结果（插图：释放液中纳米纤维结构的TEM图像）；（j）CA、Pro-CA和Pro-CA Gel的红外光谱分析；（k）CA、Pro-CA和Pro-CA Gel冻干粉末的XRD图谱。

声致余辉性能优势：深层组织成像的突破

研究团队系统比较了VP@Pro-CA Gel在超声与激光激发下的余辉性能（图4a）。在安全暴露功率范围内（超声2.0 W·cm⁻²，激光0.33 W·cm⁻²），超声激发30秒后产生的余辉强度约为激光激发90秒后的3.1倍（图4b）。进一步探究其原因发现，超声辐照下VP@Pro-CA Gel产生¹O₂的效率显著高于激光辐照，在相同时间内（60秒）¹O₂生成量达激光组的2.3倍（图4c），证明更高效的¹O₂生成是增强声致余辉信号的关键因素之一。为评估深层组织成像能力，研究者将不同厚度的鸡胸组织置于凝胶上方进行超声或激光激发（图4d）。结果显示，在组织深度超过2 cm时，光致余辉几乎无法检测，而声致余辉仍可有效激发并采集信号，两者的信背比差异在各组织深度下均显著优于近红外荧光成像（图4e）。在活体小鼠（组织深度约1.5 cm）实验中（图4f），声致余辉的信背比分别为光致余辉和荧光成像的2.6倍和14.7倍（图4g、4h）。这些数据明确表明，超声较激光具有更深的组织穿透能力，VP@Pro-CA Gel的声致余辉在深层组织成像中具有显著优势，更适用于深部肿瘤的诊疗应用。

图4.深部组织余辉成像性能评估。（a）VP@Pro-CA Gel中强声致余辉与弱光致余辉机制示意图，归因于¹O₂产生的差异，MPE：最大允许暴露量；（b）VP@Pro-CA（Pro-CA=50 mM，VP=20 μM，ONOO⁻=100 μM，V=300 μL）在指定时间的超声或激光辐照下的余辉强度，采集时间：5秒；（c）VP@Pro-CA Gel（Pro-CA=50 mM，VP=20 μM）在超声或激光辐照下随时间变化的¹O₂生成量；（d）VP@Pro-CA Gel（Pro-CA=50 mM，VP=20 μM，ONOO⁻=100 μM，V=200 μL）通过不同厚度鸡胸组织激发和检测的声致余辉、光致余辉及荧光的代表性图像及（e）信背比（SBR）；（f）VP@Pro-CA Gel在深部组织中声致余辉与光致余辉比较的示意图；（g）VP@Pro-CA Gel通过活体小鼠（约1.5 cm组织深度）的声致余辉、光致余辉及荧光的代表性图像及（h）信背比（SBR）。在d和g中，声致余辉采集时间：5秒；荧光采集时间：0.2秒。超声设置：1.0 MHz、100 Hz、50%占空比、2.0 W·cm⁻²、30秒（n=3）。

细胞水平验证：生物安全性、免疫调节与杀伤效应

生物安全性评价显示，绿原酸、Pro-CA及前药修饰基团Fmoc-Phe在小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）中即使在最高浓度下也未表现出明显细胞毒性，证实了该前药策略的优异安全性。在GL261胶质瘤细胞中，单独Pro-CA Gel组分无显著杀伤作用，而VP@Pro-CA Gel联合超声则能诱导显著的细胞毒性，表明声动力治疗中VP介导的SDT及超声空化效应在直接杀伤肿瘤细胞中发挥关键作用。细胞内摄取实验表明，VP@Pro-CA Gel释放的纳米纤维能高效递送VP进入GL261细胞胞质，其摄取效率显著优于游离VP。在免疫调节方面，研究者从小鼠股骨分离骨髓来源巨噬细胞（BMDM），经IL-4诱导为M2表型后，分别以CA和Pro-CA处理（图5a）。流式细胞术结果显示，IL-4处理组CD206（M2标志物）表达从3.65%升至18.20%，而CA和Pro-CA处理组分别降至8.48%和10.20%，证明两者均能有效逆转M2极化（图5b、5d、5e）。共聚焦显微镜下，IL-4诱导的RAW 264.7巨噬细胞呈现显著CD206绿色荧光及纺锤形形态，而CA和Pro-CA处理组中iNOS（M1标志物）红色荧光表达显著升高，细胞形态呈M1特征性卵圆形，进一步证实了CA及Pro-CA促进M2向M1极化的能力（图5c）。由此推断，VP@Pro-CA Gel在治疗过程中可重塑肿瘤微环境为促炎状态，伴随ONOO⁻水平升高，进而激活Pro-CA的声致余辉信号，实现治疗进程的实时反馈（图5f）。

图5.Pro-CA Gel的体外免疫调节性能及其与声致余辉的相关性。（a）从C57BL/6J小鼠股骨中分离BMDM并用IL-4和CA或Pro-CA处理以评估M2向M1极化效果的实验设计示意图；（b）流式细胞术定量分析BMDM中CD206⁺细胞百分比；（c）RAW 264.7巨噬细胞中CD206（绿色，M2标志物）和iNOS（红色，M1标志物）的免疫荧光染色图像（标尺：50 μm）；（d）流式细胞术分析IL-4诱导后BMDM中CD206的表达及CA或Pro-CA对CD206表达的抑制效果；（e）不同处理组中CD206⁺BMDM百分比的统计图；（f）VP@Pro-CA Gel治疗过程中ONOO⁻响应性声致余辉激活用于监测TME变化的示意图；（g）C57BL/6J小鼠术后GBM模型建立、VP@Pro-CA Gel原位注射及SDT治疗方案的时间线示意图；（h）VP@Pro-CA Gel+US治疗组在第四治疗周期中不同时间点的代表性声致余辉图像；（i）第四治疗周期中VP@Pro-CA Gel+US治疗组声致余辉信号强度的定量分析（n=3）。

体内抗复发疗效与免疫微环境重塑

研究团队建立了术后GBM复发小鼠模型，术后将VP@Pro-CA Gel原位注射至切除腔隙，并每隔4天进行SDT治疗（图6a）。活体生物发光成像显示，VP@Pro-CA Gel+US实验组对术后复发的抑制效果最为显著，优于单纯VP+US组及其他对照组（图6b、6c）。生存曲线分析表明，该实验组中位生存期较空白组延长23.5天，较VP+US组延长10.5天（图6d）。H&E染色证实VP@Pro-CA Gel+US有效抑制了左脑半球GBM复发（图6e），而主要脏器组织学检查未见明显病理改变，证实该凝胶递送系统具有良好的生物相容性。免疫荧光染色显示，对照组脑肿瘤组织中CD206（M2）高表达，而VP@Pro-CA Gel组iNOS（M1）表达显著增加，证实该治疗有效诱导了M1型巨噬细胞极化（图6f）。转录组测序分析进一步揭示，处理组小鼠脑组织中342个基因差异表达（152个上调，190个下调），KEGG通路富集分析显示上调基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT、Wnt及NF-κB等免疫相关通路（图6g）。基因本体（GO）分析亦确认了先天免疫相关通路的变化，包括细胞因子、趋化因子及免疫受体的激活（图6h）。热图显示多种促炎因子（Tnf、Il6、Il12a）及趋化因子（Ccl3、Ccl25、Cxcl9）表达显著上调（图6i），免疫浸润细胞分析显示NK细胞和细胞毒性T细胞比例明显增加，充分证明VP@Pro-CA Gel增强的SDT治疗能够有效激活脑内抗肿瘤免疫应答。

图6.VP@Pro-CA Gel的SDT用于预防GBM复发。（a）VP@Pro-CA Gel原位SDT预防C57BL/6J小鼠GBM复发的实验设计流程图；（b）SDT治疗后各复发GBM模型小鼠脑部的活体生物发光成像（荧光素钾诱导）；（c）各治疗组GBM复发模型小鼠生物发光信号强度的统计分析；（d）各GBM复发模型组小鼠的生存分析；（e）第12天各组代表性H&E染色照片显示肿瘤生长情况，标尺代表2.5 mm；（f）VP@Pro-CA及对照组脑组织免疫荧光切片（绿色代表CD206，红色代表iNOS）；（g）VP@Pro-CA Gel声动力治疗四个周期后最显著富集通路的KEGG通路富集分析条形图；（h）VP@Pro-CA Gel介导声动力治疗后小鼠左脑组织上调基因的GO富集分析，筛选标准为Padj<0.05且|log2差异倍数|>1，Padj为多重假设检验校正后的p值；（i）VP@Pro-CA Gel介导SDT后小鼠脑组织中与促炎反应诱导、抗肿瘤极化和免疫激活相关的筛选基因表达热图。显著性表示为p<0.01，*p<0.001。

总结与展望

本研究开创性地发现了天然活性分子绿原酸作为新一代高效、生物安全性优异的声致余辉底物的巨大潜力，并系统阐释了其余辉产生机制。在此基础上，团队通过对绿原酸的化学修饰构建了ONOO⁻特异性响应的Pro-CA Gel超分子水凝胶载体，其理论兼容多药共载，便于多功能拓展。负载声敏剂VP后的VP@Pro-CA Gel不仅展现出卓越的GBM术后抗复发疗效，更能通过响应肿瘤微环境中ONOO⁻水平产生与疗效相关的声致余辉发光，实现治疗效果的实时反馈。这一工作成功构建了基于绿原酸与声敏剂联用的肿瘤“治疗-监测”闭环体系，为开发兼具临床转化潜力与诊疗一体化功能的声响应制剂提供了全新范式，在该领域具有重要的创新意义和广阔的临床应用前景。