重磅！南京大学，喜获Nature⁺¹！

准确解析肽段序列，对于蛋白质组学研究至关重要。然而，由于肽段在组成和结构上具有高度复杂性，实现高精度肽序列解析仍面临显著的技术挑战。

受纳米孔核酸测序成功经验的启发，近年来的研究表明，纳米孔技术同样可以用于肽段测序。

该方法的关键在于，在肽段依次通过纳米孔并被逐步读取的过程中，获得分布集中、重复性良好且具有明确序列依赖性的电流信号事件。

为解决这一问题，来自南京大学的黄硕等研究者提出了一种基于纳米孔的肽段测序策略，称为“瞬态孔内分析物回环”（transient pore analyte looping，tPAL）。相关论文以题为“Sequential reading of a stepwise-shortened peptide immobilized on nanopore”于2026年07月29日发表在Nature上。

蛋白质是细胞内最主要的功能分子，承担着广泛而复杂的生物学功能。

蛋白质的氨基酸序列从根本上决定其三维结构与生物功能，因此，准确解析蛋白质序列对于理解生命活动机制及疾病发生发展的分子基础具有重要意义。

然而，传统蛋白质测序技术，如Edman降解法和质谱法，受检测灵敏度和动态范围限制，在低丰度蛋白质及翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）的检测方面仍存在明显不足。

因此，亟须发展单分子蛋白质测序技术，以实现对单个蛋白质分子的直接、高分辨率且对翻译后修饰敏感的序列分析。

近年来，多种具有潜力的单分子蛋白质测序技术相继出现，包括隧穿电流检测、单分子力谱、反向翻译、荧光检测以及纳米孔分析等。

尽管这些方法已经取得了显著进展，但仍面临一系列技术瓶颈。

基于隧穿电流的策略已能够检测单个氨基酸和肽段，单分子力谱技术也实现了肽段指纹识别，但基于这些原理的实用化肽段测序方法尚未得到充分验证。

反向翻译策略通过将肽段信息转换为DNA条形码实现测序，但由于可获得的特异性抗体种类有限，目前仅能识别4种氨基酸。

基于荧光的测序方法通常结合连续Edman降解或氨肽酶消化，同样难以实现完整的序列覆盖。

以Edman降解为基础的荧光测序只能识别少数经过荧光标记的氨基酸，同时还不可避免地受到标记不完全、荧光漂白以及Edman反应失败等因素的影响。

Quantum-Si公司开发的方法利用染料标记的N端氨基酸识别分子，对肽段N端进行鉴定，但由于高效识别分子的种类仍然有限，目前只能识别15种氨基酸。

纳米孔技术是开展单分子分析的重要工具，已经在核酸测序领域取得了突破性进展。

纳米孔核酸测序的成功也显著推动了纳米孔蛋白质测序技术的发展。

研究人员借鉴核酸链逐步读取的基本原理，将其拓展至肽段和蛋白质体系，先后发展出纳米孔诱导相移测序（nanopore-induced phase-shift sequencing，NIPSS）、解折叠酶介导的蛋白质测序以及电渗流阻滞蛋白质易位等方法。

然而，如何从纳米孔信号中准确解码肽段序列仍然具有较大挑战。其主要原因在于，纳米孔传感器的空间分辨率有限，同时肽段在纳米孔腔体内缺乏有效的构象约束，容易发生无规则运动，从而导致相应纳米孔信号事件分布较宽，降低了不同序列之间的判别精度。

耻垢分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porin A，MspA）是一种由八个亚基构成的锥形纳米孔，以其优异的空间分辨能力而著称，目前已被广泛应用于单分子测序和传感研究。

值得注意的是，经过镍离子结合型氮川三乙酸适配体修饰的异八聚体MspA纳米孔，即MspA–NTA–Ni，已被证明能够区分20种天然氨基酸及其翻译后修饰。

这一结果还表明，肽段的N端可以与NTA–Ni适配体发生特异性相互作用，从而通过随机传感模式实现对不同肽段的精确区分。

基于这一发现，研究人员构建了一种工程化的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porin A，MspA）纳米孔，并利用结合镍离子的氮川三乙酸适配体（NTA–Ni）和目标肽段对其进行双重修饰。

这一独特的传感构型能够将目标肽段固定在纳米孔附近，并通过多次重复读取，实现对固定肽段N端结构的精确识别。

在胆固醇修饰氨肽酶的辅助作用下，固定于纳米孔中的肽段能够以单个氨基酸为步长，从N端依次发生逐级剪切。

随着肽链逐步缩短，纳米孔电流信号呈现出与肽段序列相关的阶梯式变化，并且各级信号分布较为集中。

这些稳定且具有序列依赖性的信号特征，为肽段序列解码提供了关键线索。

该策略实现了单氨基酸分辨率，不仅能够有效识别单个氨基酸突变，还可以检测翻译后修饰以及非天然氨基酸的插入。

上述结果表明，tPAL方法具有较高的通用性和适应性，有望应用于纳米孔蛋白质组学、肽段精细结构分析以及手性肽识别等研究领域。

图1 含双活性位点的异八聚MspA的构建。

图2 通过tPAL感应对单个肽进行多次重读。

图3 通过实时酶消化产生序列依赖事件。

图4 含有串联重复序列的肽的顺序切割。

图5 解码tPAL事件的肽序列。

图6 长肽的连续切割。

综上所述，本研究开发了一种基于纳米孔的肽段分析工具，称为瞬态孔内分析物回环技术（transient pore analyte looping，tPAL）。在tPAL体系中，MspA纳米孔同时修饰有NTA–Ni适配体和目标肽段。

固定肽段的N端可通过与NTA–Ni适配体之间可逆的配位作用被反复读取。

在tPAL检测过程中，氨肽酶从肽段N端逐个切除氨基酸，使肽链按单氨基酸步长逐级缩短，进而产生与肽段序列相关的纳米孔信号事件。

通过对氨肽酶进行胆固醇修饰，可使其富集于膜附近，从而显著提高酶切效率。

基于这一原理，tPAL能够对含有单氨基酸突变、翻译后修饰（PTMs）以及非天然氨基酸（UAAs）的肽段进行连续逐步切割。

实验观察到的序列依赖性信号特征与肽段逐级缩短过程高度一致。该方法目前实现的最长读取长度为22个氨基酸。

理论上，tPAL还可用于读取更长的肽段，但本研究尚未对此进行实验验证。

此外，研究人员还开发了一套专门的数据处理流程，并利用该流程初步证明了基于tPAL信号进行肽序列解码的可行性。

然而，所采用的sgAP氨肽酶具有明显的序列特异性底物偏好。当肽段中存在某些特定氨基酸、序列组合或翻译后修饰时，其水解效率可能显著下降。

值得注意的是，tPAL体系允许在同一检测过程中同时引入多种氨肽酶或其他相关酶，因此有望通过多酶协同策略克服单一酶底物适用范围有限的问题。

对于具有高度有序结构且N端难以接近的肽段，可采用变性剂诱导其构象展开，从而暴露N端并实现有效检测。

尽管本研究主要使用人工合成肽段验证tPAL方法，但该技术同样具有分析天然蛋白质的广阔前景。

天然蛋白质可首先通过内切蛋白酶水解为较短的肽段片段，随后利用光催化C端特异性标记方法，将肽段固定到纳米孔上，再开展tPAL测量。

若进一步与高密度纳米孔阵列相结合，该技术的检测通量有望获得大幅提升。

总体而言，tPAL策略的进一步发展可能加速单分子蛋白质组学研究，并促进疾病诊断和治疗领域的新发现。

尽管本研究主要展示了其在肽段分析中的应用，但通过选择合适的反应型适配体和功能酶，该策略还有望拓展至基于纳米孔的核酸测序和聚糖测序等领域，展现出较强的平台化应用潜力。

参考文献

Chen, J., Zhang, H., Wang, K. et al. Sequential reading of a stepwise-shortened peptide immobilized on nanopore. Nature (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10881-1

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10881-1

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