AbMole 小讲堂丨Ac4ManNAz：一种糖蛋白标记试剂在蛋白质组学和细胞荧光标记中的应用

蛋白质糖基化是细胞内普遍且复杂的翻译后修饰形式之一，它与蛋白质折叠、稳定性、细胞间识别及信号传导等多种生物学过程息息相关。然而，糖蛋白的低丰度和糖链的复杂性为系统性研究糖蛋白带来了巨大挑战。Ac4ManNAz（AbMole，M66293）作为一种含叠氮基的代谢糖蛋白标记试剂，通过"代谢标记-生物正交点击化学”策略，为活细胞中的糖蛋白标记提供了重要工具[1]。Ac4ManNAz（CASNo.：1213701-11-1）的化学结构基于N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）骨架，在C1位引入了叠氮基团（-N₃），同时C2-C4位的羟基被乙酰基保护（Ac₄），这种设计赋予其独特的细胞渗透性和代谢稳定性。

Ac4ManNAz（AbMole，M66293）的标记机制分为代谢掺入和生物正交反应两个步骤。第一步为代谢掺入：Ac4ManNAz被细胞摄取后，胞质中的酯酶去除乙酰基团，释放游离的ManNAz；后者经唾液酸生物合成途径逐步转化为CMP-唾液酸-叠氮（CMP-SiaNAz），最终由唾液酸转移酶催化掺入糖蛋白和糖脂的糖链末端，形成叠氮修饰的唾液酸糖缀合物[1]。第二步为生物正交点击反应：细胞裂解后，叠氮标记的糖蛋白可与含炔基（alkyne）的功能探针（如荧光染料、生物素、同位素标签或固相载体）在铜离子催化下发生叠氮-炔环加成反应（也称之为点击化学反应），实现高效、高选择性的共价连接[2]。Ac4ManNAz（AbMole，M66293）的叠氮基团体积小、化学惰性高，在生理条件下不与细胞内任何内源性组分反应，仅在引入外源性炔基探针后发生特异性偶联，这种生物正交特性增加了标记的保真度并降低了背景干扰。

在细胞实验层面，Ac4ManNAz的标记效率已在多种细胞系中得到优化。HeLa宫颈癌细胞中，50 μM Ac4ManNAz处理24 小时可实现糖蛋白的高效叠氮修饰，标记效率随浓度和时间增加而提高，流式细胞术检测显示，Ac4ManNAz处理细胞的荧光强度（经点击化学反应偶联Cy5-alkyne后，所以能产生荧光）较未处理细胞增强约50–100倍[3]。JurkatT细胞中，100 μM Ac4ManNAz处理48小时后，约30%–50%的细胞表面唾液酸被叠氮修饰，该比例能支持后续的蛋白质组学分析[3]。在CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，Ac4ManNAz（CASNo.：1213701-11-1）的标记还能与重组蛋白表达同步进行，用于生产均一叠氮修饰的糖蛋白，这为一些抗体偶联药物（ADC）的开发提供了新策略[4]。

蛋白质组学是Ac4ManNAz（AbMole，M66293）的另一核心应用。传统糖蛋白质组学依赖凝集素亲和或肼化学法富集，存在特异性不足或操作复杂的局限性。Ac4ManNAz介导的代谢标记结合点击化学的富集方法，能实现唾液酸糖蛋白的高选择性捕获，主要流程如下：细胞裂解液与生物素-炔探针进行点击化学反应后，再使用链霉亲和素磁珠富集，随后洗脱的糖蛋白经胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，可鉴定数百至数千个唾液酸糖蛋白，覆盖度显著优于传统方法[4]。Ac4ManNAz在蛋白质组学研究中，能与稳定同位素标记（如SILAC）结合，比较不同生理或病理状态下唾液酸糖蛋白组的动态变化；在乳腺癌MCF-7细胞中，Ac4ManNAz标记结合SILAC定量揭示了雌激素刺激下E-cadherin和CD44等黏附分子的唾液酸化水平显著上调，提示唾液酸化在肿瘤转移中具有调控作用[5]。Ac4ManNAz（AbMole，M66293）还能与光交联探针联用，实现糖蛋白-相互作用蛋白的近距离标记和捕获，为解析糖蛋白的功能网络提供了新工具[5]。

Ac4ManNAz（AbMole，M66293）还在活细胞成像和追踪研究中具有重要的应用。HeLa细胞中，100 μM的 Ac4ManNAz标记4小时后，随后更换无标记培养基，并在不同时间点加入相应的荧光染料，进行点击化学反应，结果表明该方法能观察叠氮唾液酸的代谢周转和糖蛋白的亚细胞分布动态，即新合成的叠氮糖蛋白首先出现于高尔基体，随后转运至细胞膜，半衰期约12–24小时[3]。神经元细胞（SH-SY5Y）中，Ac4ManNAz标记结合荧光成像可追踪神经突触表面糖蛋白的分布和运输，揭示唾液酸化在突触形成和可塑性中的动态调控[4]。在类器官和3D培养体系中，Ac4ManNAz的标记效率与2D培养相当，且点击化学反应可在完整组织中进行，这进一步拓展了Ac4ManNAz的应用场景[5]。

Ac4ManNAz（AbMole，M66293）还能用于动物实验，在小鼠肿瘤移植模型中，腹腔注射Ac4ManNAz（50–200 mg/kg，每日一次，连续3–5天）能实现肿瘤组织糖蛋白的体内叠氮标记；标记后提取肿瘤组织，进行点击化学偶联和蛋白质组学分析，可鉴定肿瘤特异性高唾液酸化蛋白，这为肿瘤标志物发现提供新途径。

参考文献及鸣谢

[1] Saxon, E.; Bertozzi, C. R. Cell surfaceengineering by a modified Staudinger reaction. Science 2000, 287 (5460),2007–2010.

[2] Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; etal. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzedregioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. AngewandteChemie International Edition 2002, 41 (14), 2596–2599.

[3] Laughlin, S. T.; Baskin, J. M.; Amacher, S. L.;et al. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.Science 2008, 320 (5876), 664–667.

[4] Zaro, B. W.; Yang, Y. Y.; Hang, H. C.; et al.Chemical reporters for fluorescent detection and identification ofO-GlcNAc-modified proteins reveal glycosylation of the ubiquitin ligaseNEDD4-1. Proceedings of the National Academy of Sciences 2011, 108 (19),8146–8151.

[5] Boyce, M.; Carrico, I. S.; Ganguli, A. S.; et al.Metabolic cross-talk allows labeling of O-linked β-N-acetylglucosamine-modifiedproteins via the N-acetylgalactosamine salvage pathway. Proceedings of theNational Academy of Sciences 2011, 108 (8), 3141–3146.

细胞实验参考

细胞系：4T1 murine triple-negative breast cancer cells

方法：To evaluate the cytotoxicity of Ac₄ManNAz, 4T1 cells were seeded into96-well plates and incubated with a series of concentrations of Ac₄ManNAz for72 h. After incubation, cell viability was measured via CCK-8 assay. Formetabolic glycan labeling, 4T1 cells were cultured in complete mediumsupplemented with 50 μM Ac₄ManNAz for 48 h. Subsequently, cells were washedthree times with PBS and subjected to DBCO-Cy5 staining for bioorthogonal clickreaction.

浓度：50 μM

处理时间：48 h

参考文献：J Nanobiotechnology. 2024 Aug 1;22(1):461.

* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。

动物实验参考

动物模型：Female BALB/c mice bearing subcutaneous 4T1 tumor xenografts

配制： Ac₄ManNAz powder was dissolved inDMSO to prepare stock solution, further diluted with sterile PBS to obtainworking solution before injection.

剂量：40 mg/kg

给药处理：Tail vein intravenous injection (i.v.), once daily for three consecutivedays

参考文献：J Nanobiotechnology. 2024 Aug 1;22(1):461.

* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。体内实验的工作液，建议现用现配，当天使用；如在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过超声和（或）加热的方式助溶。切勿一次性将产品全部溶解。