Nature | 黄硕团队开发纳米孔“逐字读取”技术，实现单分子肽序列精准解析

蛋白质是生命活动中最核心的功能分子之一，几乎参与细胞内所有关键生物过程。从酶催化、信号传导，到免疫调控和疾病发生发展，蛋白质的结构与功能高度依赖其精确的氨基酸序列。因此，实现蛋白质序列的精准解析，是理解生命机制、发现疾病标志物以及推动精准医学发展的重要基础。该研究指出，蛋白质的氨基酸序列决定其三维结构和生物学功能，而高分辨率解析单个蛋白分子的序列信息，对于揭示复杂生命过程具有重要意义。

目前，蛋白质组学研究主要依赖质谱技术以及传统Edman降解方法。质谱技术凭借高通量优势，已经成为蛋白质鉴定的核心工具，但其在低丰度蛋白检测、翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）精准定位以及单分子水平分析方面仍存在局限。传统方法往往需要大量蛋白样本，并且难以捕获单个蛋白分子的完整信息。因此，开发能够直接读取单个蛋白质分子、同时兼顾序列信息和修饰信息的新一代蛋白质测序技术，成为生命科学领域的重要挑战。

近年来，受DNA纳米孔测序技术成功应用的启发，科学家开始探索利用纳米孔实现蛋白质和肽分子的单分子测序。纳米孔技术具有无需扩增、单分子检测以及实时读取等优势，被认为是突破传统蛋白质组学瓶颈的重要方向。然而，与结构规则、线性排列的核酸不同，肽链具有复杂的组成和动态结构，如何让单个肽分子以稳定、可重复的方式通过纳米孔，并产生能够对应氨基酸序列的特征信号，仍然是限制纳米孔蛋白测序发展的关键问题。

2026年，南京大学黄硕研究团队在Nature发表题为“Sequential reading of a stepwise-shortened peptide immobilized on nanopore”的研究论文，提出了一种全新的纳米孔肽测序策略——transient pore analyte looping（tPAL，瞬态孔-分析物环化策略）。该方法通过工程化改造纳米孔、固定单个肽分子，并结合酶促逐步切割，实现了对肽链氨基酸序列的连续读取，为单分子蛋白质测序领域带来了新的技术路线。

在本研究中，研究人员首先设计了一种特殊工程化纳米孔体系。研究人员选择具有高空间分辨率优势的Mycobacterium smegmatis porin A（MspA）纳米孔作为检测平台，并通过遗传密码子扩展技术，在纳米孔结构中特定位点引入化学反应位点，实现双功能修饰。

研究团队进一步在MspA纳米孔中引入镍离子结合的NTA-Ni适配结构，同时设计能够连接目标肽分子的反应位点，使单个肽分子能够被稳定固定在纳米孔附近。这种创新设计解决了传统纳米孔测序中肽分子运动随机、信号分散的问题，使同一个肽分子能够被多次读取。

基于这一设计，研究人员提出了tPAL检测机制。当肽分子固定于纳米孔后，其N端可以与NTA-Ni结构发生可逆结合，形成短暂的“环状”构象。由于同一个肽分子可以反复进入这一状态，因此能够产生大量高度一致的纳米孔电流事件，实现对单个肽分子的重复读取。

相比传统随机捕获模式，tPAL策略显著提高了信号稳定性。研究显示，被固定的肽分子可以产生高频、重复性的特征电流变化，并且这些信号主要由肽链N端区域决定，为后续逐步解析氨基酸序列奠定了基础。

在验证技术分辨率时，研究团队首先测试了单个氨基酸变化对于纳米孔信号的影响。通过设计20种仅N端一个氨基酸不同的肽变体，研究人员发现，tPAL能够有效区分不同氨基酸组成的肽分子。结合不同电压条件下采集的数据以及机器学习分析，分类模型最高验证准确率达到98.0%，证明该技术具备单氨基酸水平的识别能力。

为了真正实现“读取”肽序列，研究人员进一步引入氨肽酶，实现肽链从N端开始逐个氨基酸切除。每完成一次切割，暴露出的新N端都会产生新的纳米孔信号，从而形成与氨基酸排列顺序对应的一系列信号变化。

然而，传统游离氨肽酶由于距离固定肽分子较远，导致切割效率较低。针对这一问题，研究团队进一步对氨肽酶进行胆固醇修饰，使其富集于膜附近，提高局部酶浓度，从而增强酶促切割效率。利用这一优化体系，研究人员成功观察到完整的连续切割过程，并获得与肽链长度一致的多个信号阶段。

例如，在七肽LEFTRSC分析中，研究团队观察到了7个连续阶段，每一个阶段对应一个新的N端氨基酸暴露状态。通过这些连续信号变化，可以追踪肽链从第一个氨基酸到最后一个氨基酸的完整变化过程。

除了普通肽序列，该技术还展示了对复杂蛋白质信息的解析能力。研究人员进一步测试了包含氧化、乙酰化、三甲基化等翻译后修饰的肽分子，发现tPAL能够区分不同修饰类型，即使某些修饰具有相似质量，也能够通过信号差异实现识别。此外，该技术还能够检测包含非天然氨基酸的肽分子，显示出在合成生物学和药物研发中的潜在应用价值。

在序列解码方面，研究团队建立了基于机器学习的数据分析框架。由于每一次tPAL信号不仅包含当前N端氨基酸信息，还携带部分下游序列信息，因此研究人员提出基于3-mer（连续三个氨基酸组合）的解码策略，并结合机器学习模型完成肽序列重构。该方法降低了单分子信号随机误差，提高了序列预测可靠性。

进一步实验显示，研究团队成功解析了来源于人源septin 7蛋白片段的22个氨基酸长度肽段，实现了连续22个氨基酸阶段的读取，证明tPAL不仅适用于短肽分析，也具有向蛋白质片段测序拓展的潜力。

总之，该团队利用纳米孔技术提出tPAL策略，通过“固定肽分子—重复读取—逐步切割—信号解析”的创新模式，实现了单分子肽序列的高分辨率解析。该研究将纳米孔检测从传统的“随机捕获分子”模式转变为“主动控制并重复读取单个分子”的模式，大幅提高了信号稳定性和序列解析能力。通过结合工程化纳米孔、化学连接策略、酶促反应以及人工智能分析，该技术实现了单氨基酸分辨率检测，并能够识别突变、翻译后修饰以及非天然氨基酸插入等复杂信息。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10881-1

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