【JACS】南京大学潘惠杰/梁勇：通过辅因子工程策略改造天然谷胱甘肽，将谷胱甘肽S-转移酶（GST）重编程为人工光酶

研究背景

能量转移（EnT）光催化能够突破热反应的热力学限制，实现一系列激发态特有的有机转化，其中[2+2]光环加成是构建环丁烷骨架的核心方法。在传统小分子催化体系中，研究者已通过手性光敏剂、光敏剂-手性酸组合等策略，实现了烯酮、喹诺酮、肉桂酸酯等多种底物的对映选择性[2+2]环加成。但截至目前，能够直接构建手性双环磺内酰胺（bicyclic sultam）骨架的对映选择性[2+2]光环加成反应仍未被开发，是不对称光催化领域的难点。

光酶催化结合了光化学活化与酶的手性空腔调控能力，为激发态反应的立体控制提供了全新解决方案。当前人工光酶的构建策略主要包括非天然氨基酸基因编码、光敏剂共价连接与超分子锚定，但这些方法普遍存在操作复杂、模块化不足、适配蛋白骨架有限等短板。针对这一问题，潘惠杰课题组前期提出了“辅因子工程策略”：将NAD+辅酶的烟酰胺功能单元替换为二苯甲酮光敏剂，开发出NAD型人工辅因子BpAD，可通过天然的辅酶-蛋白相互作用，将多种NAD结合蛋白直接重编程为人工光酶，实现对映选择性[2+2]环加成（Nat. Catal.2025, 8, 822）；后续修饰得到的MeO-BpAD还进一步实现了分子间[2π+2σ]环加成反应（J. Am. Chem. Soc.2026, 148, 13755）。

为验证该设计原理的普适性，团队将研究范畴从经典辅酶拓展至天然辅因子—谷胱甘肽（GSH）。谷胱甘肽在生物体内广泛存在，对应的谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白家族成员众多、结构多样，是构建人工酶的理想骨架库。

前沿科研成果

近日，南京大学潘惠杰/梁勇团队报道了一种新型谷胱甘肽型人工光辅因子体系：通过对谷胱甘肽进行化学修饰，引入二苯甲酮光敏单元，得到光活性辅因子GS-Bp1。该辅因子可模拟天然GSH的结合模式，与多种GST蛋白通过弱可逆且特异性的相互作用组装，直接将天然谷胱甘肽结合蛋白重编程为人工光酶。

基于该体系，团队首次实现了磺酰胺底物的分子内对映选择性[2+2]光环加成，高效构建手性双环磺内酰胺骨架。通过蛋白筛选与定向进化，人源GST A1-1突变体可催化合成一系列双环磺内酰胺产物，产率中等至优异，对映选择性最高可达99% ee，转化数（TON）最高达480，催化效率比小分子二苯甲酮催化剂高出两个数量级以上。结合光谱表征与分子动力学模拟，研究证实定向进化通过重新平衡过渡态中的π-π堆积作用与色散作用，精准调控了反应的立体选择性。该工作将辅因子工程策略从NAD+辅酶拓展至谷胱甘肽类分子，建立了人工酶构建的通用平台。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

反应开发与优化

团队以2-芳基磺酰胺底物的分子内[2+2]环加成为模型反应，目标构建手性双环磺内酰胺骨架。研究设计合成了两种GSH衍生光辅因子：含经典二苯甲酮单元的GS-Bp1，以及带有酰胺取代基的红移类似物GS-Bp2，二者均可通过简便的化学修饰制备，体现了GS辅因子平台的模块化优势。

空白对照实验表明：无辅因子、无蛋白时反应完全不发生；仅加入游离GS-Bp1/GS-Bp2仅有微弱活性，且无对映选择性，证明蛋白骨架是催化活性与立体控制的核心。随后团队筛选了多种来源的GST家族蛋白，结果显示：

1. GS-Bp1与人源hGST A1-1组合性能最优，初始条件下获得38%产率与67% ee；

2. 不同蛋白与辅因子的配对可呈现不同的对映偏好，证明该体系可通过组分搭配调控立体化学结果；

3. 单独hGST A1-1无催化活性，进一步验证了光活性辅因子的必要性。

研究通过分子动力学（MD）模拟解析了GS-Bp1在hGST A1-1活性口袋中的结合模式：谷胱甘肽部分与天然GSH结合模式高度一致，保留了与T74、R51等残基的氢键用；二苯甲酮单元则占据底物结合口袋，与F226形成π-π相互作用。基于该结构模型，团队锁定活性口袋内靠近光敏单元的关键位点（L113、V117、L219、F226等），开展定向进化改造：

1. 单点突变 L113V：对映选择性从67% ee提升至85% ee；

2. 引入第二位点V117I：产率从32%提升至49%，ee进一步升至89%；

3. 第三突变L219I：产率达51%，ee提升至92%。

在此基础上，团队系统优化了缓冲体系、pH值、共溶剂比例、光照强度等反应参数。最优条件下，模型产物2a的分离产率可达90%，对映选择性达97% ee；降低人工酶量至0.5 mol%时，仍能保持62%产率与96% ee，展现出优异的催化周转能力。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

底物普适性考察

在最优突变体与反应条件下，团队对底物适用范围进行了全面考察：

芳环取代基：对位烷基、烷氧基等给电子取代基耐受性良好，叔丁基等大位阻基团仅轻微降低产率，不影响对映选择性；吸电子卤素取代会使产率有所下降，但ee值基本保持，且卤素原子半径越大，负面影响越显著；间位、邻位取代呈现相似规律。

环尺寸拓展：磺内酰胺环从五元环拓展至六元环时，反应可顺利进行，产物ee值高达98%；进一步拓展至七元环则完全失活。

杂芳环底物：吡唑、噻吩、呋喃等杂芳环替代苯环后，反应均能高效进行，对映选择性普遍高于90%，部分底物ee值可达99%。

官能团影响：磺酰胺的NH基团对催化至关重要，烷基化修饰后产率与ee均大幅下降；烯烃端的额外取代基也会因位阻效应显著降低反应性能。

与小分子二苯甲酮催化体系相比，该人工光酶反应速率提升超过两个数量级：小分子体系通常需要10 mol%以上载量、反应96小时以上，而人工酶体系3小时内即可达到高转化率，转化数（TON）最高可达480。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

机理研究与选择性起源

为揭示催化机制与立体选择性来源，团队开展了多维度的实验与计算研究：

结合亲和力表征：等温滴定量热（ITC）测试显示，GS-Bp1/GS-Bp2对GST蛋白的结合亲和力远强于天然GSH，Kd达到微摩尔级别，与天然辅酶-蛋白的结合强度相当。这一增强源于二苯甲酮单元引入的额外π-π堆积与色散相互作用。

激发态动力学研究：瞬态吸收光谱表明，游离GS-Bp1的激发态会被氧气显著淬灭（寿命从 12.7 μs缩短至2.4 μs）；而与蛋白组装后，氧气淬灭效应大幅减弱，证明蛋白空腔对激发态起到了保护作用，与实验中氧气不影响反应效率与选择性的结果一致。

反应动力学验证：时间进程实验显示，游离辅因子几乎无活性，与蛋白组装后反应速率显著提升；改变蛋白与辅因子的摩尔比例可调控反应速率，但不改变对映选择性，证明催化活性与立体控制均来自蛋白-辅因子组装体。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

立体选择性起源：DFT计算证实C1-C4成键是反应决速步。MD模拟与结合自由能分析表明：野生型酶中，TS-S构型因更强的π-π堆积作用更稳定，但色散作用会优先稳定TS-R，部分抵消π-π的优势，因此ee值中等；定向进化的突变通过选择性削弱稳定TS-R的色散作用，重新平衡两种非共价相互作用，使TS-S的能量优势逐步扩大，最终实现了高达99%的对映选择性。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

该工作开发了一类谷胱甘肽型人工光辅因子，成功将天然GST家族蛋白重编程为高选择性人工光酶，首次实现了双环磺内酰胺骨架的对映选择性[2+2]光环加成，填补了不对称光催化领域的空白。

研究将辅因子工程策略从经典NAD+辅酶拓展至谷胱甘肽类分子，验证了“保留天然结合模块、替换功能单元”设计思路的通用性。这种可逆、模块化的组装方式，无需复杂的基因操作或蛋白修饰，即可实现人工辅因子与多种天然蛋白的配对筛选，为人工酶的快速构建与定向进化提供了通用平台。该策略未来可进一步拓展至更多非天然转化，持续拓展酶催化的反应边界。

论文信息

Reprogramming Glutathione-Binding Proteins into Artificial Photoenzymes by Engineered Glutathione-Type Cofactors

Chang Wang, Jinmeng Yu, Hongwei Chen, Wenhao Hu, Huan Wang, Yong Liang,* and Hui-Jie Pan*

Journal of the American Chemical Society, DOI: 10.1021/jacs.6c05795

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