Nature Communications | 清华大学李赛团队开发FlyTomo实现冷冻电镜断层数据实时处理

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的数据处理流程从原始电影的运动校正、CTF估计与校正，到倾斜序列的组装与对齐、断层图重建与去噪，再到颗粒识别和亚断层平均以及后期的精修，每个环节都涉及不同软件和参数的调试，这种繁琐且高度依赖经验的工作流使得cryo-ET在结构生物学领域的普及率在近五年里不升反降。2026年7月28日，清华大学李赛课题组在《Nature Communications》发表了题为“FlyTomo: a streamlined software for on-the-fly cryo-ET data processing and diagnosis”的研究论文。研究团队开发了FlyTomo软件平台，该平台将cryo-ET数据处理从帧对齐贯通到亚断层平均，并且在数据采集过程中提供实时诊断反馈，在纯化蛋白酶体、冠状病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒、裂谷热病毒和酿酒酵母冷冻薄片等多种真实样品上验证获得了3.4 Å到7.3 Å分辨率的结构。

FlyTomo的设计包含了三个层面的创新。第一个层面是一条覆盖全流程的自动化处理管线，其中的参数组合经过了大量真实实验数据的校验和优化，能够适应有金标和无金标、分子样品和细胞薄片等不同场景。第二个层面是一套实时诊断系统，能够在每一组倾斜序列采集完成后的几分钟内完成断层图重建，并自动提取显微镜状态、数据质量和样品完整性的关键指标，比如离焦值、CTF拟合分辨率、金标轨迹残差、束倾斜程度以及感兴趣区域的位移情况，这些诊断结果通过图形界面直观呈现。第三个层面是一条离线干预-再处理回路，用户根据诊断报告对个别步骤进行调整后可以重新执行处理而无需从头开始整个流程。在计算效率上，FlyTomo实现了内存内计算，将MRC格式电影的I/O负载降低约60%；动态任务分配机制可同时处理多组倾斜序列，节省约46%的时间；并行无损压缩可将MRC原始数据的存储占用减少90%以上。

实时诊断模块会为每一张倾斜图像计算离焦值和CTF拟合分辨率并展示功率谱，研究人员可以快速识别那些因电子束不稳定或样品缺陷导致异常的图像并将其剔除。对于倾斜序列的对齐质量，软件会绘制金标或块追踪的轨迹图同时给出残差均值和标准差，帮助发现错误匹配的金标或内在的载台漂移。软件还会监测倾斜过程中感兴趣区域在不同角度下的视野重叠情况，并用不同颜色标示位移大小。在完成粗略对齐之后，FlyTomo能够在数分钟内重建出解卷积的断层图供用户进行立体评估。采集结束后，所有诊断指标被汇总成一份可编辑的报告，包含束倾斜的分布直方图、残差误差的统计、像散的极坐标图、薄片预倾角和厚度的直方图以及每张断层图的中心切片快照，研究人员可以据此快速筛选出高质量的数据集用于后续精细处理。

研究团队在多个真实生物学场景中对FlyTomo进行了严格测试。在纯化的20S蛋白酶体标准样品上，软件处理了40张无金标倾斜序列并识别出34,380个颗粒，最终获得3.4 Å分辨率的图谱，侧链密度清晰可见。在HCoV-229E冠状病毒上，S蛋白三聚体在每个病毒颗粒表面平均只有大约9个拷贝且存在结构异质性，研究团队用FlyTomo处理了818张断层图涵盖5,621个病毒颗粒，将S蛋白三聚体解析到3.90 Å，局部分辨率达到3.75 Å。在甲型流感病毒上，血凝素（HA）三聚体分子量仅190 kDa，在传统单颗粒分析中容易产生优势取向问题，FlyTomo从65张断层图（363个病毒颗粒）中解析出了3.6 Å分辨率的结构，局部分辨率达到3.4 Å，这是迄今为止cryo-ET获得的最小分子量蛋白质的近原子分辨率结构。在VSV的RNP螺旋组装体上，这种复合物具有高度柔性且螺旋参数变化较大，研究团队从122张断层图中选取147个病毒颗粒，经过刚性对齐和子框提取获得4.6 Å图谱，局部分辨率达4.3 Å。在裂谷热病毒数据集上，数据采集自较老旧且稳定性欠佳的Tecnai F30 Polara电镜，FlyTomo的诊断功能揭示出比对照组更大的像散、更分散的束倾斜和更高的对齐残差，研究团队依据诊断报告筛选了213张断层图，最终将Gn-Gc五聚体解析到7.3 Å。在酿酒酵母冷冻薄片上，FlyTomo测量了整个数据集的几何参数，从185张断层图中解析出4.3 Å的80S核糖体结构，大部分区域局部分辨率达3.8 Å的数据奈奎斯特极限。与Tomo Live、TomoBEAR、Warp等工具相比，FlyTomo在实时诊断和全流程覆盖上具有独特优势，未来将引入机器学习建立样品-电镜特征签名以指导自适应采集和处理。

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