浙江
单个活细胞内部生物分子的动态变化直接调控着基因表达、代谢活动和信号转导，传统分析方法却往往需要裂解细胞或提取内容物后才能开展后续检测，这种操作方式无法在细胞保持生命活性的前提下持续追踪分子的实时波动。近日，中国科学院化学研究所吴海臣研究员和 西华大学刘蕾教授 团队在《PNAS》上发表了题为《In situ and real-time monitoring of intracellular activities in single live cells using a nanopore probe》的研究论文，他们设计了一种将氧化铝纳米吸管膜与玻璃纳米孔膜整合在同一探针中的新装置，该探针能够穿透单个海马神经元并同步监测谷氨酸、抗坏血酸和三磷酸腺苷这三种小分子的浓度变化。第一作者是博士研究生黄孝斌，通讯作者是吴海臣研究员和西华大学刘蕾教授。
这支研究团队构建的探针外层是一根尖端带有纳米吸管膜的毛细管，纳米吸管通过原子层沉积技术在径迹刻蚀的聚碳酸酯膜上镀上氧化铝层并经过反应离子刻蚀制得，每根吸管的长度大约为1.5微米、直径约为100纳米。探针内层则是一块玻璃纳米孔膜，该膜上支撑着一层脂双层结构，脂双层中嵌入了经过化学修饰的耻垢分枝杆菌孔蛋白A突变体。他们在这个突变体上连接了1,10-菲咯啉基团并引入铜离子形成配位中心，当谷氨酸、抗坏血酸或者三磷酸腺苷分子靠近铜离子的时候，每个分子都会引起特征性的电流阻断信号，这些信号的幅度和持续时间各不相同，研究团队就靠着这些差异来识别和定量不同的分子。
为了验证纳米吸管膜提取细胞内分子的实际效果，他们在膜上方放置了钙黄绿素荧光示踪剂并且用该膜穿刺海马神经元，施加-100毫伏电压十分钟后，显微镜下可以清楚地看到膜下方神经元内部充满了绿色荧光，而膜覆盖区域之外的细胞则没有荧光信号。穿刺之后的神经元经过钙黄绿素AM和碘化丙啶双染，结果显示绿色荧光占绝对主导而红色荧光信号几乎不可见，这说明了纳米吸管穿刺对细胞膜的损伤极小且细胞保持了很高的存活率。研究团队还进行了乳酸脱氢酶释放测定和线粒体膜电位检测，结果同样证实这种氧化铝纳米吸管膜具有良好的生物相容性。
他们随后利用这套探针系统监测了氧糖剥夺条件下神经元内三种分子的动态变化，氧糖剥夺会抑制细胞的氧化磷酸化和糖酵解过程从而阻断三磷酸腺苷的合成。在普通氧糖剥夺模型中，三磷酸腺苷和谷氨酸的捕获事件数量在记录开始后迅速降低，抗坏血酸的减少速度则相对平缓一些，同时神经元胞体在十五分钟之内出现了明显的肿胀。研究团队在抑制性模型中加入了N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗剂AP5，他们发现谷氨酸和三磷酸腺苷的下滑速率相比普通模型明显减慢并且胞体面积几乎没有发生改变，这说明抑制该受体能够缓解能量耗竭和氧化应激压力。而在加入激动剂NMDA的兴奋性模型中，三种分子的消耗速度都进一步加快，神经元胞体在五分钟内就达到了最大肿胀程度，这证实了受体过度激活会急剧恶化兴奋性毒性损伤。
这项技术为神经细胞缺血缺氧损伤机制的研究提供了直接观测手段，未来若将探针与微流控芯片和人工智能辅助的数据分析结合起来，药物筛选和个体化疾病诊疗领域或许能获得新的突破。
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