Nature！山东大学药学院展鹏教授/高升华副研究员联合破解克里米亚-刚果出血热病毒聚合酶RNA合成机制、发现两类抑制剂并揭示其作用机制

导读

近日，山东大学药学院展鹏教授/高升华副研究员联合中国科学院广州生物医药与健康研究院、中国科学院武汉病毒研究所、广州实验室、广州医科大学等单位研究团队，在国际顶尖学术期刊Nature在线发表题为“Structures and inhibition of the Crimean–Congo haemorrhagic fever virus polymerase”的原创性研究成果。该研究依托药物化学与结构生物学深度交叉的全链条新药研发体系，首次系统解析克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）聚合酶多个RNA合成相关功能状态结构，揭示了病毒RNA识别、RNA延伸及相关的聚合酶动态调控机制，并从原子尺度阐明两类代表性抗病毒药物分子的作用机制，为靶向CCHFV聚合酶的新型抗病毒药物研发提供了关键结构基础与理论支撑。

中国科学院广州生物医药与健康研究院/广州国家实验室熊晓犁研究员，广州国家实验室陈新文研究员，山东大学展鹏教授，武汉病毒研究所王曼丽研究员、邓增钦研究员为本文的共同通讯作者。中国科学院广州生物医药与健康研究院副研究员薛璐、研究生桂嘉诚、潘海内，中国科学院武汉病毒研究所博士吴凡，山东大学药学院副研究员高升华，武汉病毒研究所副研究员匡文华、广州医科大学博士研究生常添彩为论文共同第一作者。

克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）是一类经蜱虫传播的高致病性布尼亚病毒，可引发重症出血热疾病，临床致死率达40%，被WHO列为优先研发医疗防控手段的重点病原体之一。当前全球无获批疫苗、无特异性抗病毒药物。CCHFV编码的L蛋白是一种RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），负责病毒RNA基因组的转录和复制，是抗病毒药物研发的重要靶点。但该蛋白分子量巨大、构象高度复杂，长期缺少原子级三维结构，同时领域内长期缺少活性明确、机制清晰的先导小分子，结构缺失与药物分子匮乏形成双重瓶颈，极大阻滞特效新药研发。

攻克超大聚合酶结构解析难题

为药物化学提供原子级精准靶点模板

联合团队首先建立了CCHFV聚合酶表达纯化及体外RNA合成体系，成功获得RNA延伸产物，并利用冷冻电镜技术解析了包括apo状态、5′vRNA结合状态、3′vRNA结合状态以及RNA延伸状态在内的多个关键功能状态结构，较为系统地呈现了CCHFV聚合酶从RNA识别到RNA延伸过程中的结构变化。研究团队进一步揭示了CCHFV聚合酶调控RNA合成的分子机制。证实病毒特异性5′和3′端RNA启动子协同调控聚合酶活性，并首次鉴定出一个参与调控聚合酶RNA合成活性的锌结合位点；同时解析了活性中心内模板-产物双链、待掺入核苷三磷酸（NTP）的精准识别模式，揭示了病毒RNA合成过程中模板识别及RNA链延伸的分子机制。

值得注意的是，CCHFV聚合酶拥有区别于其他布尼亚病毒的特有构造：启动RNA延伸后，大量外周结构域呈现出高程度的结构有序性，并通过与聚合酶核心区域的相互作用得到稳定。其中，病毒特有“OE linker”结构域与以及其他扩展序列形成区域参与外围结构域的定位与稳定，保障RNA高效合成。团队进一步解析了介导帽抢夺（cap-snatching）过程的内切酶（endonuclease，Endo）结构与功能机制：在聚合酶延伸复合物中观测到底物RNA结合于内切酶活性口袋，并发现全新“Endo linker”结构元件，该片段直接参与底物RNA识别。上述全部结构特征精准定位内切酶口袋、RdRp催化中心两大可成药位点，为后续药物化学分子骨架改造、选择性优化、亲和力提升提供不可或缺的三维原子模板。

发现两类抑制剂并阐明作用机制

为候选药物发现奠定基础

基于完整的聚合酶结构基础，团队系统阐释了两类不同作用靶点抑制剂的作用机制，为靶向药物的结构优化与分子迭代提供了精准靶点依据。团队通过前期抗流感领域的工作积累，发现流感病毒药物巴洛沙韦（Baloxavir）及其衍生物WXSH0208虽然能够抑制CCHFV感染，但其抑制活性较针对流感病毒时显著降低。进一步通过X射线晶体学解析了WXSH0208与Kasokero virus（KASV，与CCHFV高度相近的内罗病毒）内切酶（Endo）片段共晶结构，发现其通过双金属离子螯合机制占据内切核酸酶（Endo）结构域，占据RNA结合区域并干扰RNA底物识别，从而抑制病毒内切酶活性。

团队通过筛选验证，发现核苷类化合物2'-脱氧-2'-氟胞苷（2FC）展现出纳摩尔级强效抗CCHFV活性（EC50=75.7 nM），选择指数超1980。研究首次明确其作用于RdRp催化活性中心，并且揭示其通过“转位后链终止”（post-translocation termination）机制抑制RNA合成：它以三磷酸活性形式（2FC-TP）被聚合酶识别为底物，正常掺入新生RNA链并完成易位（进入-1位）；随后其2'-氟原子会干扰催化位点关键残基（S2516、H2477）对核糖3'-OH的空间取向调控，同时削弱3'-OH的亲核性，阻断下一个核苷酸的磷酸二酯键形成，从而终止RNA链延伸。以上结果阐明了含氟核苷类似物2FC抑制CCHFV RNA合成的分子机制，为开发靶向病毒聚合酶的新型核苷类抗病毒药物提供了重要的结构基础。

药物化学赋能全链条研发

多学科交叉助力抗病毒药物发现

山东大学药学院药物化学团队依托长期抗流感、HIV、尼帕病毒药物化学平台积淀，参与小分子活性化合物的发现、合成优化、结构表征与体外活性评价，为抑制剂分子机制解析提供了核心物质支撑。优化建立了2FC三磷酸活性中间体的制备工艺，解决体外生化、冷冻电镜复合物制备的原料瓶颈。同时，结合结构生物学解析结果，系统阐明了两类抑制剂分子优化的关键位点与改造方向，为后续靶向药物的精准迭代、药效提升提供了专业的药物化学解决方案，是本次跨单位交叉攻关不可替代的核心力量。

本研究首次从原子层面全景解析了CCHFV聚合酶的复制调控机制与两类先导分子差异化抑制机理，一举破解高危蜱传病毒“无靶点结构、无强效先导药”双重研发卡点。其中药物化学全链条创制工作实现从靶点三维结构到实体抗病毒候选分子的关键转化，不仅为CCHFV特效治疗药物的理性骨架改造、药效升级提供完整结构与分子依据，更搭建起适用于全布尼亚病毒科广谱抗病毒新药研发、可复制的“结构-药物化学”交叉标准化技术范式。本次联合攻关充分彰显了结构生物学、病毒学与药物化学交叉融合在重大新发突发传染病防控中的核心价值，为全球重大新发传染病药物研发提供可借鉴的攻关路径。

本研究得到中药功效成分发掘与利用全国重点实验室、国家自然科学基金创新研究群体项目及山东大学抗病毒及重大慢性疾病药物研发团队的支持，是继团队在尼帕病毒聚合酶抑制剂理性设计研究登上《Cell》之后，依托药物化学学科优势，服务国家重大传染病防控战略取得的又一标志性突破。该工作将“结构解析—机制阐明—分子创制”的交叉研发范式从副黏病毒拓展至布尼亚病毒，不仅进一步夯实了我国在高致病性蜱传病毒先导分子创制、抗病毒新药理性设计领域的国际引领地位，也有力提升了山东大学抗病毒药物化学方向的学术影响力和学科辐射力。

伊利诺伊大学芝加哥分校荣立军教授为该工作提供了重要指导和帮助；山东大学创新药物研究院院长刘新泳教授为本项目开展给予了大力支持。

来源：山东大学齐鲁医学院