Nat Commun丨汪海林/赵强团队开发毫秒级闪离电泳技术，揭示人cGAS-DNA凝聚体zeta电势双电性调控新机制

细胞内的生物分子凝聚体通过液-液相分离（liqiud-liqiud phase separation，LLPS）形成无膜细胞器，在诸多生命活动中发挥关键作用。作为其中的经典代表，细胞质 DNA 传感器蛋白 cGAS 在识别异常DNA后会通过相分离形成微米级液滴，这些凝聚体作为高效的“微型反应器”，在启动抗病毒免疫和维持细胞稳态中扮演着核心角色。然而，决定凝聚体结构稳定性和功能的关键物理化学属性——凝聚体的表面电荷特性长期以来如同“黑箱”，缺乏高分辨率的解析工具，其真实的电荷情况及生物学功能一直是个未解之谜。

近日，中国科学院生态环境研究中心汪海林研究员、赵强研究员团队在 Nature Communications 上发表题为 Electrostatic bimodality of human cytosolic DNA sensor cGAS-dsDNA condensates revealed by millisecond flashing electrophoretic separation 的研究论文。该研究自主开发了毫秒级闪离电泳（millisecond flashing electrophoretic separation，msFES）技术平台，首次在近单液滴水平上揭示了cGAS-DNA凝聚体存在内在的电荷双模态分布——相同条件下形成的液滴可呈现截然相反的表面电荷（zeta电势）。研究不仅打破了“同种凝聚体电荷均一”的传统认知，更揭示了这种电荷差异决定了液滴对DNA降解酶TREX1的不同命运：带正电的液滴抵抗TREX1切割，而带负电的液滴则被选择性清除。该发现为理解相分离系统的电荷调控提供了全新视角。

基础发现与技术突破：msFES实现凝聚体近单液滴高效分离

研究团队发现相分离液滴在电泳分离中表现出“毫秒级闪离效应”，利用该发现开发了Mg2+介导的msFES平台将毛细管电泳的高效分离与激光诱导荧光的超高灵敏度相结合，实现了：纳升进样，样品消耗仅约10 nL，较传统方法降低4个数量级；单个液滴通过检测窗口时产生约160 ms的窄峰，宽度仅为自由DNA分子峰宽的1/5–1/30，实现近单个凝聚体高效分离。常规电泳峰通常遵循高斯分布，符合菲克扩散，而此处观测到的毫秒级闪离峰表现出非玻尔兹曼分离行为，表明检测达到了单液滴水平。

为明确建立msFES中的闪离峰与cGAS-dsDNA液滴之间的关联，研究团队针对关键LLPS调控结构域进行了系统突变，DNA结合位点C（一个关键电势相互作用界面）中的R300E/K301E双突变导致闪离峰近乎完全抑制，表现为数量减少56%，稀相DNA浓度增加5.6倍，荧光成像证实了液滴数量的减少。截短突变体Δ146（去除1–146位残基，即N端无序区）显著改变闪离峰数量增加3.0倍，而平均荧光强度下降72%。将Δ146与R300E/K301E突变组合后，LLPS产生协同抑制：液滴数量减少93%，平均荧光强度下降86%，稀相DNA增加60倍。这些结果系统证实闪离峰来源于离散的LLPS液滴。物种特异性分析显示，小鼠cGAS（其DNA结合位点C的结构较弱）的闪离液滴峰数量较人类cGAS减少68%，平均荧光强度降低73%，与荧光成像结果一致。有趣的是，增强dsDNA结合亲和力的E401A突变（位于DNA结合位点A）（Kd=54±3 nM vs. 野生型120±6 nM）却意外损害LLPS，使闪离峰减少38%，荧光强度降低57%。结合亲和力与相分离之间的这种反向关系表明，LLPS需要动态多价性而非过度稳定性。

msFES在近单液滴分辨率下对生物分子液滴进行ζ电位测量的原理。

核心发现：相同分子、相同条件，却有两种电荷分布

应用msFES分析hcGAS-dsDNA凝聚体时，研究人员发现了一个出乎意料的现象：在完全相同的组分和条件下形成的液滴，竟呈现出两种截然不同的zeta电位分布：带负电群体：zeta电位集中在−32.5至−37.5 mV；带正电群体：zeta电位集中在+22.5 mV。两种液滴在新鲜制备和老化样品中均稳定共存。

这一电荷双模态现象并非偶然，而是由液滴内部DNA与hcGAS的化学计量比决定的：DNA相对比例高的液滴带负电，hcGAS相对比例高的液滴带正电。更有趣的是，这种比例分配受到离子含量（Na+、Mg2+）的调控。在缺乏Na⁺或Mg²⁺时，几乎观察不到正电势液滴。在固定5 mM Mg²⁺条件下，随着NaCl浓度的升高，正电液滴比例上升。在150 mM NaCl时，液滴几乎全部带正电（ζ=+6.3±2.7 mV），负电几近消失（2.4%）。

这一动态演变过程也得到了双色荧光成像技术的印证。在缺乏Na⁺或Mg²⁺时，dsDNA/hcGAS荧光强度比保持较高（平均比值0.95–0.99），并近似单峰正态分布。在同时含有Na⁺和Mg²⁺且Na⁺范围为20–100 mM的体系中，dsDNA/hcGAS比值呈现双峰分布（高斯拟合R²>0.85）。150 mM Na⁺和 5 mM Mg²⁺存在时，则dsDNA/hcGAS比值更低，且呈现一个近单峰分布。荧光成像分析dsDNA/hcGAS比值的分布可以与msFES分析hcGAS-dsDNA凝聚体凝聚体zeta电势分布对应。

体外的双模态现象是否在真实的细胞环境中同样存在？为回答这个问题，研究者对体外模拟生理盐浓度条件下和细胞来源的cGAS-DNA凝聚体进行验证。结果表明，在接近生理状态下正电势凝聚体占更高的数量比例。

功能验证：zeta电势决定液滴对TREX1敏感性

这种电荷上的差异，究竟有着怎样的生物学意义？研究团队将目光投向了细胞质中关键的DNA降解酶TREX1，该核酸酶负责清除异常DNA以防止自身免疫激活。

结果显示，带负电的液滴对带正电荷的TREX1高度敏感，20分钟内总荧光强度下降87%，DNA被迅速降解；带正电的液滴则表现出显著的抵抗性，荧光强度在40分钟内不降反升。更值得注意的是，TREX1切割后，部分带负电的液滴转化为带正电的状态，提示存在一种电荷介导的动态重塑机制。

带负电荷的液滴对TREX1切割敏感，导致其迅速降解，并部分转变为带正电荷的状态。这一转变至关重要，因为由此产生的正电液滴对TREX1具有抵抗性。这些易感群体与抗性群体之间的相互作用，共同调节着数字化的hcGAS激活过程。

病理意义：肿瘤相关突变破坏电荷调控

为了探究这一机制的临床相关性，研究团队测试了天然存在于肿瘤细胞中的hcGAS突变体 (如子宫内膜癌中的K432T，以及G303E)。这些突变定位于DNA结合位点C (site C)，该区域包含KRKR环，在LLPS过程中促进液滴融合。尽管两种突变体保留了与野生型相当的DNA结合亲和力，也能正常发生LLPS，但在相同条件下它们形成的凝聚体尺寸显著缩小。凝胶电泳和msFES分析显示，K432T和G303E凝聚体内的dsDNA对TREX1切割较野生型hcGAS液滴中的DNA更敏感。

与野生型hcGAS相似，TREX1消除了K432T和G303E突变体体系中的负电液滴，同时伴随体系向以正电zeta液滴为主导的状态转变。然而，TREX1处理后正电液滴平均和总荧光强度的增强在两种突变体中均显著弱于野生型，尤其在20分钟时。这种差异在整个60分钟消化期间持续存在。两种突变均位于hcGAS-DNA结合界面的位点C，该区域在凝聚过程中对多价相互作用至关重要，研究团队认为，突变体正电势液滴生长的能力受损是导致TREX1高敏感性的根本原因。

总结与展望

该研究不仅开发了凝聚体电势分析的新型工具平台（msFES），更揭示了相分离系统中一个隐藏的调控维度——zeta电势。这种基于zeta电势的调控机制，为理解cGAS-STING通路的精细调控提供了全新框架。msFES平台的通用性使其可推广至其他相分离系统（如神经退行性疾病相关凝聚体），有望在更大范围内揭示电荷调控的普适规律。

中国科学院生态环境研究中心汪海林研究员和赵强研究员为论文共同通讯作者。中国科学院生态环境研究中心凌晓婷博士为为论文第一作者。中国科学院生态环境研究中心江桂斌院士和中国科学院上海有机化学研究所刘聪研究员在研究过程中提供了宝贵的指导与合作。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-73740-7

制版人： 十一

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