万字长文，功能增强型ADC的最新进展

引言

ADCs通过将单克隆抗体的靶向特异性与高效细胞毒性药物相结合，已成为肿瘤治疗的革命性策略。ADCs源于20世纪初Paul Ehrlich提出的“魔法子弹”理论，此后经历了四个发展阶段。第一代ADCs使用鼠源单克隆抗体，通过不可切割连接子与传统细胞毒性药物结合，存在载荷毒性不足、结构不稳定、毒素易脱落等局限性，导致治疗窗口窄和失败率高。第二代ADCs使用人源化单克隆抗体、更稳定的可切割连接子和更有效的细胞毒性药物，解决了免疫原性和载荷不受控释放的问题。第三代ADCs利用定点偶联技术实现均一的药物抗体比（DAR），降低毒副作用并增强疗效，从而拓宽了治疗窗口。目前，ADCs已发展到第四代，采用多特异性、多载荷和高DAR值的创新设计。迄今为止，全球已有21种ADCs获批上市，超过300种ADCs候选药物处于临床试验阶段，涵盖血液恶性肿瘤和实体瘤等多种癌症类型。

尽管ADCs在肿瘤治疗中取得了显著成功，多种药物已获批，传统基于单克隆抗体的ADCs仍面临许多挑战，包括靶抗原表达异质性、药物内吞不足、载荷相关耐药性以及治疗相关不良事件。为克服这些局限性，研究人员提出了多种优化策略，并开发了多种下一代ADC技术。传统ADCs具有三个关键要素：特异性识别肿瘤相关抗原的抗体、细胞毒性载荷以及将载荷与抗体连接的连接子。近年来，ADCs的概念已显著扩展，催生了更广泛的XDC平台。靶向部分不再局限于完整的IgG抗体，现已包括更小、穿透性更强的模块，如纳米抗体、亲和体、DARPin、适配体、靶向肽甚至小分子配体。载荷也已超越传统的高效小分子细胞毒性药物，包括免疫激动剂、光敏剂、放射性核素、寡核苷酸、PROTAC分子及其他功能性效应分子，实现了多样化的作用机制，克服耐药性，激活免疫反应，或实现时空控制性杀伤。然而，这些发展也面临双组分或多组分偶联工艺复杂以及新型载荷安全性问题等挑战。这些发展代表了ADCs从单一结构实体向多功能、精准导向治疗药物演进的核心趋势。

当前的ADCs研究策略主要集中于连接子可控稳定性、定点均质偶联、抗体优化、载荷多样化、旁观者效应的精确调节以及PK/PD优化。总体目标是提高疗效、降低毒性、克服耐药性并增强在实体瘤中的治疗效果，从而推动ADCs向更高均质性、智能性、安全性和广谱适用性发展。

一、双抗ADC

传统的单靶点ADCs在临床应用中取得了显著成功，但仍面临许多挑战，如靶抗原异质性、耐药性以及靶点在正常组织中表达导致的on-target-off-tumor毒性。为克服这些局限性，双特异性抗体药物偶联物（BsADCs）应运而生。BsADCs可同时识别并结合两种不同的细胞表面抗原（双靶点ADC）或两种不同的表位（双表位ADC），这种设计不仅提高了对肿瘤细胞的靶向特异性，还可能通过协同效应增强ADCs的内吞效率和抗肿瘤活性。

双靶点ADCs

目前已经开发了多种双靶点ADCs策略，其中许多已进入临床试验。

靶向EGFR/HER3/c-MET信号通路的BsADC:EGFR是ERBB受体酪氨酸激酶家族成员，可与HER3或c-MET形成异二聚体，从而触发下游信号通路促进肿瘤细胞增殖。EGFR的阻断可能导致通过ERBB受体（如HER2和HER3）的代偿性信号传导。因此，已开发了多种靶向EGFR和HER3的BsADCs。其中最具代表性的是由百利药业开发的BL-B01D1，它利用靶向EGFR和HER3的双特异性抗体SI-B001。拓扑异构酶I抑制剂（TOP1i）ED04通过可切割连接子连接到SI-B001的半胱氨酸位点上，DAR为8。在异种移植模型中，双特异性ADC BL-B01D1显示出比由抗EGFR或抗HER3亲本单抗与相同连接子和载荷制备的ADCs更强的肿瘤抑制能力。临床数据显示，BL-B01D1在已产生多药耐药的晚期肺癌和鼻咽癌患者中具有令人鼓舞的抗肿瘤疗效。此外，BL-B01D1显示出可接受的安全性和耐受性，为经过多线治疗的晚期肿瘤患者提供了一种新的治疗选择。该药物目前处于临床III期研究（NCT06118333）。

MET的上调和扩增被认为是抗EGFR治疗的主要逃逸途径之一。靶向EGFR和c-MET的BsADCs可实现协同有效的肿瘤杀伤，同时延缓耐药性的发生。目前已有三种EGFR/c-MET BsADCs进入I/II期临床试验。AZD9592由阿斯利康开发，构建于DuetMab单价双特异性IgG平台支架上，通过引入Fab二硫键防止轻链错配，并通过可切割连接子连接到TOP1i载荷AZ0132，DAR为6。其被设计为对c-MET的亲和力比对EGFR高15倍以上，以减少正常组织中EGFR驱动的毒性。AZD9592在结直肠癌患者来源的异种移植模型中表现出剂量依赖的抗肿瘤活性，并对KRAS/BRAF突变或伊立替康耐药的肿瘤保持活性。VBC101由VelaVigo Bio开发，也具有低亲和力EGFR臂和高亲和力c-MET臂，确保减少正常组织中EGFR相关的非靶毒性。其在IC50方面比仅靶向c-MET的ABBV-399提高了五倍。使用纳米抗体设计使其结构更小，比ABBV399和AZD9592具有更好的肿瘤渗透性和积累。另一种EGFR/c-MET BsADCPRO-1286由普方生物开发，由单价BsAb组成，具有精细调节的EGFR和c-MET亲和力，与TOP1i sesutecan偶联，DAR为8。PRO1286在广泛的肿瘤细胞系中表现出高效内吞和亚纳摩尔级细胞毒性效力，在多种靶表达水平、肿瘤类型和基因组背景的小鼠异种移植模型中显示出显著剂量依赖性抗肿瘤活性。

靶向共表达抗原的BsADCs:近期研究揭示了多种用于构建BsADCs的新药物靶点。一些设计聚焦于共表达靶点以增强肿瘤选择性。D'Alessio等人开发了靶向P-钙黏蛋白（pCAD）和LI-钙黏蛋白（CDH17）的BsADC，这两种蛋白属于钙黏蛋白超家族。pCAD参与上皮细胞的钙依赖性细胞间黏附，并与多种促肿瘤过程相关，包括细胞侵袭、转移和肿瘤发生。CDH17是一种细胞黏附分子，主要通过介导钙依赖性细胞黏附，在维持上皮细胞极性和组织稳态中发挥重要作用。这两种蛋白在结直肠癌中高度共表达，设计的BsADC可选择性地进入双阳性细胞而非单抗原细胞，从而减少了与每种抗原相关的潜在正常组织负担。pCAD/CDH17双特异性ADC的体内研究显示，其对双抗原表达肿瘤具有抗增殖效应，而对单抗原表达肿瘤无作用。

Tang等人开发了一种同时结合CDH17和鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）的双特异性抗体，并将其与铁死亡诱导剂RSL3（一种GPX4抑制剂）结合，创建了一种创新的BsADC。GUCY2C是一种I型跨膜受体，在正常肠道上皮细胞中表达，通过其激素配体激活后调节肠道稳态和肿瘤发生。他们发现CDH17和GUCY2C在结直肠癌细胞中共过表达。实验结果表明，与单克隆抗体ADCs相比，该BsADC表现出更好的结合和内化活性，有效抑制肿瘤细胞增殖，同时保持良好的安全性。

Song等人开发了靶向上皮细胞黏附分子（EpCAM）和紧密连接蛋白3（CLDN3）的BsADC。尽管EpCAM在多种肿瘤中高表达，但它也在正常胃肠道组织中表达，限制了单靶点ADCs的开发。鉴于CLDN3和EpCAM在多种恶性肿瘤中高度共表达，而CLDN3在正常组织中很少存在，他们开发了靶向EpCAM和CLDN3的BsADC，以避免高表达EpCAM正常组织的毒性。该BsADC有效抑制肿瘤生长，同时对仅高表达EpCAM的细胞显示出弱结合，表明对正常组织毒性较低。

靶向互补表达靶点的BsADCs:一些研究还靶向肿瘤中表达的互补靶点，以更全面地消除肿瘤细胞，降低耐药可能性。由AbbVie开发的BsADCABBV-969是这种设计的典型代表。ABBV-969靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）和前列腺肿瘤抗原（STEAP1）。PSMA和STEAP1均在前列腺癌中高表达，并表现出互补的表达特征。肿瘤内部和肿瘤间的异质性表达可能限制治疗效果。ABBV-969采用双可变结构域免疫球蛋白（DVD-Ig）形式设计，同时靶向STEAP1和PSMA。这种形式允许对两种靶点具有二价性，增加了肿瘤覆盖率和治疗持久性。ABBV-969已进入I期临床试验（NCT06318273）。

遵循相同策略，Yao等人近期开发了一种人源化双特异性ADC，同时靶向MET和recepteur d'origine nantais（RON）受体。在超过40%的胰腺癌和三阴性乳腺癌病例中，MET和RON表达存在显著异质性。因此，他们开发了双特异性抗体PCMbs-MR，并将其与一甲基奥瑞他汀E（MMAE）偶联，形成BsADC PCMbs-MMAE。这种BsADC有效诱导MET和RON的内化，并在MET/RON表达异质性的癌细胞系中触发大量细胞死亡，表现出高效且持久的抗肿瘤效应和良好的安全性。

双表位ADCs

作为一种特殊类型的BsADCs，双表位ADCs的特点是能够同时识别并结合单一靶蛋白上两个不同的非重叠表位，从而增强受体聚集并导致靶标的快速内化。目前对双表位ADCs的研究主要集中在HER2、MET和叶酸受体α（FRα）靶点上。

靶向HER2的双表位ADCs:在Coats等人发表的一项研究中详细阐述了双表位ADCs的作用机制。他们将曲妥珠单抗的scFv融合到39S IgG1重链的N端，以特异性结合HER2的胞外结构域2（ECD2）和ECD4。他们发现这种结构有效促进了HER2受体的聚集，从而加速其内吞、运输到溶酶体以及最终的降解过程。每个重链上的两个工程化半胱氨酸（S239C和S442C）允许通过马来酰亚胺己酰基连接子精确连接微管聚合抑制剂tubulysin，产生具有定义DAR为4的均质BsADCMEDI4276。在I期临床试验中，MEDI4276在对曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和T-DM1耐药的患者中显示出抗肿瘤活性。然而，伴随增强疗效的是副作用，这限制了其临床应用。

ZW49是建立在bsAb ZW25基础上的ADC，来源于Azymetric Fc平台，结合了靶向ECD4的scFv和识别ECD2的Fab臂。ZW49通过蛋白酶可切割连接子将bsAb ZW25与化疗来源的微管抑制剂Auristatin连接，DAR为2。在临床前研究中，ZW49在低和高HER2表达的乳腺癌细胞系以及PDX模型中显示出增强的内吞和抗肿瘤活性。尽管ZW49在I期临床试验中显示出可接受的安全性，但其临床开发随后因Zymeworks优先考虑其他在研项目而被搁置，其未来策略尚不明确。

此外，靶向HER2的双靶点ADCs还包括DXC018和JSKN003。DXC018由杭州多禧生物科技有限公司开发，在抗体设计上使用与ZW25相同的靶向ECD4的scFv和靶向ECD2的Fab臂；在载荷设计上，包含一种抗代谢抑制剂和一种TOP1i，总DAR为12（两种载荷比例未公开），有效诱导DNA损伤和细胞毒性效应。双靶点设计增强了亲合力和内化，而双载荷设计在多种HER2阳性肿瘤模型中表现出细胞毒性活性。JSKN003是基于抗体KN026的改进设计。与ZW49类似，它靶向两种不同的HER2表位（曲妥珠单抗对应ECD4，帕妥珠单抗对应ECD2）。通过位点特异性聚糖偶联，重链的聚糖通过可切割四肽连接子经点击化学与TOP1i连接，DAR为3.6。I期和II期临床数据表明，JSKN003在既往接受过多线治疗的HER2阳性乳腺癌（包括接受过T-DXd治疗的患者）中显示出令人鼓舞的疗效和可控的安全性。双表位HER2抗体设计可能增强了其结合效率，并贡献了观察到的临床获益。目前，JSKN003已进入III期临床试验（NCT06079983）。

靶向MET的双表位ADCs:REGN5093-M114由再生元制药开发，是一种双表位MET ADC，将双表位MET抗体通过蛋白酶可切割连接子与美登素类载荷M24偶联，DAR为3.2。其在MET高表达的异种移植肿瘤模型中显示出良好的疗效和安全性。后续研究进一步揭示了其细胞内加工机制。进入细胞后，REGN5093-M114首先内化进入分选内体，然后快速转运至循环内体，并逐渐到达晚期内体。有趣的是，循环内体在不同癌细胞中介导了高达35%的MET和EGFR ADCs的加工过程，这一过程由定位于该区室的组织蛋白酶L介导。临床前研究表明，REGN5093-M114不仅对常规MET高表达肿瘤有效，而且对多种耐药肿瘤（如MET或EGFR继发性改变以及其他获得性改变）也有效。目前，REGN5093-M114正在进行I/II期临床试验（NCT04982224）。

靶向FRα的双表位ADCs:叶酸受体FRα参与肿瘤浸润、转移和进展，使其成为肿瘤治疗中的吸引目标。IMGN853是全球首个且唯一获批的靶向FRα的ADC药物。然而，IMGN853在FRα低至中表达的患者中疗效较差，限制了其在更广泛患者群体中的使用。为提高抗体内化能力和细胞内毒素释放效率，从而改善FRα低表达患者的疗效，已开发了靶向FRα的双表位ADCs。靶向FRα的双表位ADC IMGN151由具有不对称Fab-ScFv的抗体组成，靶向不同的FRα表位，并携带一种新型美登素类毒素DM21，通过可切割肽连接子偶联。与上一代FRα ADC IMGN853相比，IMGN151的双表位设计增强了其与靶细胞的结合，使其能够更有效地递送药物分子。在体内，IMGN151也显示出显著优势，具有改善的药代动力学特性，并在多种模型中表现出卓越的抗肿瘤疗效，目前正在进行II期临床试验（NCT07024784）。

近期美国癌症研究协会（AACR）的摘要还展示了两种FRα双表位ADCs的临床前数据。GenSci140由长春金赛药业开发，由靶向FRα不同表位的Fab和单域重链抗体（VHH）组成，通过可切割连接子携带TOP1i抑制剂载荷，DAR为6，可同时结合肿瘤细胞上FRα抗原的不同表位并通过强效内吞进入细胞，即将进入I期临床试验（NCT07251166）。IBI3010由信达生物开发，由靶向FRα的双表位抗体与新型TOP1i NT1偶联组成，具有均一的DAR为8，据报道在源自不同FRα表达水平的细胞系的各种异种移植模型中表现出良好的疗效和安全性。

尽管BsADCs在多项研究中显示出有前景的治疗效果，但其发展仍面临重大挑战。候选药物如ZW49的早期临床结果已提示潜在安全风险，多抗原靶向可能导致累积毒性。此外，某些双特异性构建体尺寸增大会损害肿瘤渗透，而复杂的分子设计和制造工艺带来额外限制。这表明BsADCs的靶点选择和亲和力优化需要严谨考虑，同时分子设计必须平衡结构复杂性和制造可行性。尽管面临诸多挑战，BsADCs的发展为下一代ADCs的合理设计提供了关键方向。

二、内化增强型ADCs

ADCs的基本作用机制依赖于其抗体部分与肿瘤细胞表面特异性抗原结合，然后通过受体介导的内吞作用实现内化。内化后，ADC复合物在溶酶体中被降解，释放出细胞毒性药物，诱导细胞凋亡或死亡。因此，内吞作用是决定ADCs疗效的关键步骤。目前已开发了多种策略来提高ADCs的内吞效率，例如上述双表位ADC设计、靶向快速周转受体以及引入肽标签以增强内吞或溶酶体靶向等。

靶向快速组成型周转靶点

除了上述针对两个具有协同效应肿瘤抗原的双靶点策略外，另一种替代性双特异性ADC策略是通过靶向快速周转的受体来增强药物内吞和细胞内运输。尽管某些肿瘤相关抗原是理想的靶点，但其自身内化效率相对较低，限制了ADCs的疗效。因此，增加一个经历快速内化的额外靶向受体，所形成的BsADC可以“搭乘”快速周转受体的内化途径，将细胞毒性载荷高效递送到肿瘤细胞内部，从而增强杀伤效果。许多此类靶点已得到充分研究，如CD63、催乳素受体（PRLR）和淀粉样前体样蛋白2（APLP2）。

近期研究已发现一些用于设计增强内吞作用BsADCs的新兴靶点。Zhang等人开发了一种靶向SORT1和HER2的BsADC，用于低HER2表达肿瘤。利用SORT1的快速内化特性，这种BsADC不仅增强了在HER2低表达肿瘤细胞中的结合和内化，还促进了HER2降解，在动物模型中显示出强大的抗肿瘤活性。类似地，Chen等人开发了靶向SLC3A2和PD-L1的BsADC，使用SLC3A2（也称为CD98hc）作为靶点以增强内化。这种BsADC有效促进了内化能力差的PD-L1的溶酶体靶向和降解，在PD-L1低表达肿瘤模型中显示出优于单靶点ADCs的抗肿瘤活性。Tsuchikama等人采用了不同策略，利用化学方法构建双特异性ADC。他们选择叶酸（FA）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）作为配体，分别靶向FRs和整合素，其中RGD是三肽序列，作为整合素家族受体的识别位点，而叶酸是FRs的天然配体。通过支链连接子技术构建的靶向FRs/HER2的BsADC表现出特异性结合和高细胞毒性。配备RGD肽的整合素/HER2 BsADC也在整合素或HER2阳性细胞中表现出靶标特异性结合和细胞毒性。

除了上述经典内吞途径外，利用非经典内吞途径也是增强ADC递送的有效策略。2021年发表的一项研究探讨了NOTCH3靶向ADCs的作用机制。这项研究发现，当NOTCH3受体与配体DLL4结合时，它介导了NOTCH3-ADC向表达该配体的邻近细胞的跨细胞内吞作用，使得NOTCH3靶向ADC不仅能够杀伤表达靶抗原的受体细胞，还能被递送到不直接表达靶抗原但表达其配体的肿瘤细胞中，从而扩大了杀伤范围。这种NOTCH3-ADC的非典型细胞毒性机制在异种移植模型中显示出优于标准化疗的持续肿瘤缩小效果。另一项研究探讨了通过p38介导的非经典内吞途径促进EGFR靶向ADCs的细胞内递送。该研究发现，尽管西妥昔单抗等抗体抑制配体诱导的EGFR内吞，但化疗药物如肿瘤坏死因子α（TNF-α）或顺铂可通过激活p38途径强烈诱导西妥昔单抗-EGFR复合物的内吞。与该复合物相关的ADCs也可被内吞，增强了抗增殖活性。这项研究揭示了通过药物组合诱导非经典内吞途径可以绕过某些抗体对经典内吞的抑制作用，从而有效提高ADCs的细胞内递送效率。这些非经典内吞途径的确定为ADCs的设计提供了新见解。

在最近的一项研究中，研究人员将关注点转向了受体泛素化。Zhuang等人开发了一种靶向受体泛素化的ADC策略（ubitaADCs），将基于抗体的靶向与膜相关E3泛素连接酶的选择性招募相结合，从而将肿瘤相关受体重新引导至泛素依赖性内吞途径，以加速ADCs的内化和增强溶酶体运输。以EGFR和HER2为范式靶点，他们证明这种策略能够在保持高亲和力抗原识别的同时，实现膜相关E3泛素连接酶RNF43和ZNRF3的可控参与，从而在多种结直肠癌模型中实现改善的细胞内载荷递送、细胞毒性反应和肿瘤杀伤。在体内，ubitaADCs比传统ADCs表现出更优的抗肿瘤疗效。

降解剂-药物偶联物（DDCs）的出现为ADCs的设计和开发提供了新方向。Wells等人利用快速内化子低密度脂蛋白受体（LDLR）作为溶酶体运输效应分子，开发了LDLR靶向嵌合物（LIPTACs）。LIPTACs能够实现多种膜蛋白的选择性高效溶酶体降解。通过VC连接子连接细胞毒性载荷MMAE，这种新型DDC在体外可将传统ADCs的效力提高高达20倍（如图4d所示）。Fang等人提出了一种小分子-肽偶联物版本的DDC。利用环五肽（RGDyK）和小分子BMS-8分别作为αvβ3整合素和PD-L1的结合基序，通过组织蛋白酶B可切割连接子与MMAE连接，该DDC在体外和体内均显示出有前景的抗肿瘤活性。

引入肽标签

细胞穿透肽（CPPs）被广泛认为是促进细胞内递送的工具。这些能够穿越细胞膜的短肽可以将治疗性分子递送到细胞内，从而改善药物的生物利用度和治疗效果。CPPs内化的详细机制仍不完全清楚。含有赖氨酸或精氨酸的阳离子CPPs积聚在带负电的膜表面，通过吸引与CPPs带电氨基酸结合的水分子进入脂质双层的疏水核心。除了这种直接穿透外，CPPs还可能通过各种内吞途径进入细胞。在抗体和ADC药物研究中，CPPs可用于增强这些治疗性蛋白药物的细胞内递送效率，在癌症治疗中显示出巨大潜力。

Mier等人探讨了将四面体CPPs（tCPP）与抗体和ADCs偶联的效果。研究发现，这种偶联技术可将抗体的细胞内摄取率提高高达四倍，同时保持其靶向特异性。当将这项技术应用于已获批的ADC药物ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla）时，所得的tCPP-ADC偶联物在体外细胞毒性研究中表现出比原药高6倍的细胞毒性。然而，在体内研究中，与未修饰的抗体相比，tCPP-mAb偶联物未能表现出增强的肿瘤积累；相反，它显示出减少的肿瘤富集和更快的血液清除。这些发现表明这种策略可能容易产生脱靶效应。

类似的应用包括溶酶体分选信号肽（LSSs）。溶酶体靶向受体的内吞作用由受体胞质结构域中存在的信号介导。大多数信号基于双亮氨酸或酪氨酸的肽基序，这些基序被网格蛋白外壳的组分识别，以确保蛋白质通过网格蛋白介导的内吞作用准确运输到溶酶体。Cai等人探索了一种增强纳米抗体-药物偶联物（NDCs）溶酶体靶向和疗效的蛋白标记方法。在他们的研究中，通过分选酶介导的连接，在抗EGFR纳米抗体7D12的C端标记溶酶体分选基序NPGY（Asn-Pro-Gly-Tyr），以增强网格蛋白介导的内吞作用。用NPGY或RRRRRRRRRRNPGY基序标记产生了两种NDCs（7D12-MMAF-P1/P2），其溶酶体靶向特性和抗肿瘤活性显著改善。基于CPPs和LSSs，过去几年已开发了多种基于抗体的靶向蛋白降解技术。GlueTAC和Pro-MPD通过将CPP与纳米抗体结合构建，而SignalTAC通过将阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体信号肽融合到IgG重链和轻链的C端构建。这些应用表明化学修饰策略在扩展生物试剂可应用性方面的潜力，而非特异性结合的可能性及其潜在的脱靶毒性也为未来研究带来了挑战。

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三、共价结合的ADC

以共价方式与其靶标结合的小分子药物取得了巨大成功并重新兴起。近年来，研究人员也将这一策略应用于共价蛋白药物的开发。化学工程化的共价亲和蛋白可以与靶蛋白形成稳定持久的共价键，增强其与靶标的结合。共价蛋白的核心设计涉及将化学反应的官能团（共价弹头）整合到亲和蛋白支架中。当亲和蛋白识别并结合靶蛋白上的特定位点时，该弹头与靶蛋白表面附近的亲核氨基酸残基（如半胱氨酸、赖氨酸等）发生化学反应，形成稳定的共价键。

硫酰氟交换（SuFEx）是一种新兴的点击化学反应类型，在共价药物开发中显示出巨大潜力。Yan等人通过使用基于SuFEx化学的马来酰亚胺取代芳基氟硫酸酯（MFS）共价弹头的化学附着，成功开发了靶向HER2的共价亲和蛋白-药物偶联物。他们选择了两种常见的亲和蛋白——亲和体（ZHER2:342）和单体（Adnectin）作为靶向部分，以及铜绿假单胞菌外毒素（PE24）作为细胞毒性载荷，构建了蛋白偶联物。体外实验表明，MFS-ZHer2与HER2的共价结合超过72%，细胞摄取比非共价对照组高185%。在体内实验中，与非共价亲和蛋白药物偶联物相比，两种共价偶联物在肿瘤部位表现出更快、更强、更持久的药物富集。

最近，该团队进一步开发了靶向HER2和EGFR的双特异性共价亲和蛋白-药物偶联物AAA-PE24。该设计包括三个关键组分：靶向HER2/EGFR的双靶点配体部分（ZHER2:342和Adnectin）连接至MFS弹头、延长半衰期的白蛋白结合结构域（ABD035）以及提供抗肿瘤活性的PE24毒素部分。结果显示，其共价交联性能比单价药物提高了440%至630%，细胞内摄取增加了290%至340%，肿瘤滞留时间延长了360%至460%。在HER2/EGFR阳性胰腺肿瘤模型中，这种双价药物的肿瘤抑制率达到90.4%，显著优于单价或非共价药物（28.4%至66.9%）。总之，这些结果证明了基于SuFEx的共价策略在蛋白药物开发中的成功。共价蛋白药物可以通过MFS连接子中的芳基氟硫酸酯与靶标上的亲核残基之间的邻近触发反应进行不可逆交联，从而形成一种有前景的药物模式，具有快速肿瘤靶向、永久性受体结合、有效药物积累和快速残余代谢的特点。

基于SuFEx的共价亲和蛋白药物表现出更高的肿瘤富集、更持久的靶结合能力和更强的细胞内化。然而，这种共价特性导致其与受体（无论是肿瘤细胞还是正常细胞上）发生不可逆结合，可能导致系统性毒性，提示在后续研发中应选择更具特异性的肿瘤靶点。

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四、多载荷ADC

在ADCs中，载荷是直接杀伤肿瘤细胞的最终效应组分，其效力、选择性和可控性决定了ADCs的疗效和安全性。目前获批的ADC载荷包括两类微管抑制剂（奥瑞他汀类和美登素类）、两类DNA损伤剂（卡奇霉素类和PBD）、两类TOP1i（DXd和SN-38）以及一种细菌毒素（PE38，已于2023年撤回）。然而，单载荷ADCs的单一作用机制使肿瘤细胞易于产生耐药性，直接影响ADCs疗效。为克服肿瘤异质性和耐药性，提出了多载荷组合策略。双载荷ADCs将具有相同或不同作用机制（MOA）的两种载荷偶联到同一抗体上，形成多维协同肿瘤杀伤策略，克服了传统ADCs依赖单一载荷的局限性。

相同MOA的双载荷组合

微管抑制剂MMAE和MMAF具有互补的物理化学性质。MMAE的疏水性赋予其高细胞膜通透性，使其能够通过旁观者效应消除邻近细胞。然而，作为多药耐药（MDR）外排泵的底物，MMAE在高泵表达细胞中的活性降低。相比之下，MMAF受药物外排影响较小，对MDR阳性细胞具有高感染性，但细胞通透性有限。

基于这些独特特性，多项研究通过不同的连接方法设计了使用MMAE和MMAF的双载荷ADCs。Senter等人利用正交保护半胱氨酸残基的顺序去保护方法制备了均质的MMAE/F双载荷ADC（DAR 8+8）。Tsuchikama等人通过化学酶法偶联生成了一系列具有组合DAR 2+2、4+2和2+4的均质双载荷ADCs。他们利用MTGase介导的双功能支链连接子偶联，随后通过正交点击反应连接两种载荷模块，获得了具有确定DAR的均质双药物ADCs。类似地，Kayser等人尝试将MMAE与另一种微管抑制剂DM1组合。曲妥珠单抗通过可切割连接子（Val-Cit）连接MMAE，再通过不可切割连接子（MCC）连接DM1，构建了Tmab-VcMMAE-MCC-DM1。微管抑制剂的组合显示出比单药更好的疗效，并在体外和体内均表现出显著抗肿瘤效果，证明了该策略的有效性。

近年来，该研究团队一直专注于蛋白载荷的精确偶联，并开发了一系列糖基化位点特异性ADC技术，以方便天然IgG的修饰。在早期研究中，利用野生型内切糖苷酶的水解活性及其突变体的转糖基化活性实现了抗体糖基化的均质控制。随后，通过将野生型EndoS2与二糖基底物LacNAc结合，对ENGase催化的化学酶促策略进行了修饰，以支持抗体的一步糖工程化，从而允许在没有抗体预工程化的情况下将细胞毒性药物位点特异性偶联至糖基化位点。还建立了一种使用硫酯基酰基转移试剂的示踪策略，以支持位点特异性ADCs的一步制备。通过结合这些偶联方法，实现了在一锅反应中将载荷连接到K248位点和保守的N-糖基化位点N297的双位点特异性ADCs。通过EndoS2催化的一步糖工程化在糖基化位点安装了LacNAc-连接子-MMAE/MMAF载荷，并使用基于FcBP的药物底物在K248位点引入了第二种载荷。构建的双载荷ADCs，如先前报道，显示出可接受的均质性、优异的缓冲液稳定性以及增强的体外和体内效率。

该机制的另一个例子是TOP1i的组合，利用两种不同的依喜替康载荷：一种发挥旁观者活性以应对肿瘤异质性和低靶表达，另一种在癌细胞中积累以实现更高效力，从而最大化肿瘤特异性活性。一篇AACR摘要展示了一种新型双TOP1i ADC。他们利用曲妥珠单抗作为靶向抗体，两种不同的TOP1i作为载荷，生成了抗HER2双载荷ADC，DAR为2+2，在体内研究中显示出优越的抗肿瘤疗效，在循环中具有优异的稳定性，无载荷丢失或连接子切割迹象。

不同MOA的双载荷组合

癌细胞通常对单药治疗产生耐药性。因此，结合不同MOA的抑制剂有助于克服耐药机制，因为对一种药物耐药的细胞可能仍对另一种药物敏感。

微管抑制剂加DNA损伤剂：吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓（PBD）是一类从链霉菌中发现的具有抗肿瘤活性的天然产物。PBD选择性地在DNA小沟中烷基化，导致DNA链交联并引起DNA损伤，从而诱导细胞凋亡。Dimasi等人通过使用三功能连接子将MMAE和PBD（SG3457）偶联到抗体上的同一位点，构建了双载荷ADC。该连接子包含一个用于在曲妥珠单抗上特异性结合的N-芳基马来酰亚胺，以及用于药物偶联的炔基和酮基。所得的双载荷ADC在HER2表达的MDA-MB-453细胞中显示出显著的体外抗肿瘤效果。除了在同一连接子上偶联不同载荷外，Rader等人利用抗体不同位点的工程化硒代半胱氨酸和半胱氨酸残基构建了具有MMAF和DNA损伤剂PNU-159682的双载荷ADC。该双药物ADC对HER2表达细胞系显示出选择性和强效的细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。PNU-159682因其DNA损伤活性导致S期细胞周期停滞，而MMAF同时抑制微管聚合并导致G2/M期细胞周期停滞。然而，由于这些PBD弹头的高细胞毒性，这些研究中的双载荷ADCs被发现与PBD单载荷ADCs效力相当，且都强于MMAE/MMAF ADCs。这表明在这种设计中，细胞毒性主要由DNA损伤载荷介导。

TOP1i加微管抑制剂：Matsuda等人将微管抑制剂与TOP1i结合在同一ADC上，以增强疗效和应答持久性。第一个载荷MMAE在Lys248位点引入，形成DAR为2的ADC。在切割链间二硫键后，通过硫醇-马来酰亚胺反应引入第二个载荷deruxtecan，最终DAR为10（2+8）。该双载荷ADC对HER2阳性细胞表现出优异的体外细胞毒性，优于T-DXd，并在NCI-N87异种移植模型中增强了肿瘤抑制作用。一篇AACR摘要展示了一种靶向Nectin-4的新型三价ADC，将MMAE与两种不同的TOP1i结合，DAR为2+2+2。在Nectin-4高表达乳腺癌SUM-190PT异种移植模型中，三重弹头ADC导致持久且完全的肿瘤消退。单独使用相应DAR的MMAE（DAR 2）和TOP1i（DAR 2+2）单载荷ADC组合，在相同剂量下未显示应答。此外，该ADC在小鼠、食蟹猴和人血清中保持优异稳定性，无连接子-载荷解偶联或连接子切割，DAR保持不变。

TOP1i加RNA聚合酶II抑制剂：KH815是一种靶向TROP2的ADC，是首个进入临床试验的双载荷ADC。它采用半胱氨酸和N297偶联技术，整合了TOP1i抑制剂依喜替康和RNA聚合酶II抑制剂雷公藤甲素，平均DAR约为7.5（4+3.5）。依喜替康通过马来酰亚胺连接子和二肽可切割连接子随机偶联到KH815的半胱氨酸上，而雷公藤甲素通过四肽连接子与二苯并环辛炔基团连接至N297位点的修饰糖基上。体外和体内稳定性研究表明，雷公藤甲素从抗体骨架上的释放速率显著高于依喜替康。含雷公藤甲素的ADC分子的半衰期为22.6小时，而含依喜替康的ADC分子半衰期约为56.2小时。KH815的双重作用机制可同时抑制RNA合成和诱导DNA双链断裂，在体外和体内异种移植小鼠模型中，与等效或更低剂量的其他TOP1i-TROP2靶向ADCs相比，表现出更强的抗肿瘤活性。此外，KH815显示出克服TOP1i-ADC耐药性的潜力。目前，KH815正在进行I期临床试验（NCT06885645）。

TOP1i加DNA损伤反应抑制剂：由TOP1i诱导的复制应激激活的DNA损伤反应（DDR）通路已被确定为TOP1i不敏感的重要驱动因素。因此，同时抑制TOP1和DDR可能克服耐药性并使肿瘤对TOP1i更敏感。共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶（ATR）作为DDR中的关键调节因子，已成为极具潜力的组合靶点，其抑制对肿瘤细胞表现出选择性毒性。HMBD-802（也称为CLIO-8221）是一种新型抗HER2双载荷ADC，结合了TOP1i和ATRi载荷。通过MTG介导的生物偶联，专有连接体锚定在抗HER2抗体上，然后通过点击反应连接TOP1i和ATRi载荷，生成DAR为4+4的双载荷ADC。HMBD-802在多种T-DXd敏感细胞系中表现出优越的体外疗效，并在T-DXd耐药异种移植模型中实现了肿瘤细胞杀伤。目前，HMBD-802正在进行I/II期临床试验（NCT07300943）。

在最近的一项研究中，Meng等人设计了一种用于可编程药物组合的多载荷ADC架构。T1000是一种稳定的连接子，由二肽VA连接子和聚肌氨酸（10个单位）修饰的自降解间隔基p-氨基苄基组成。将多T1000载荷（MTP）直接偶联到天然抗体上，或将两种MTP组合、依次偶联到抗体的工程化和天然半胱氨酸上，形成了可编程组装的协同载荷-抗体比例偶联物（SPARCs），具有2-6个载荷，总DAR高达30，可调载荷比例从1到10。与单TOP1i ADC和游离药物联合相比，他们构建的将TOP1i与DDRi结合的SPARC表现出优越的疗效和改善的安全性，降低了血液学毒性，并同步改善了载药制剂的药代动力学。

与免疫调节剂结合的策略

对先天免疫细胞进行治疗性刺激可以诱导抗肿瘤反应并克服对免疫治疗的耐药性。多种先天免疫受体（如Toll样受体TLRs和干扰素基因刺激剂STING）的激动剂已被证明具有强效免疫调节活性，并能促进癌症治疗。通过将抗体与免疫激动剂结合，免疫刺激抗体偶联物（ISACs）利用抗体的靶向能力将免疫激动剂直接递送到肿瘤或特定靶点部位，从而改善免疫抑制性肿瘤微环境，增强抗肿瘤效果，并减少全身副作用。尽管ISACs面临显著的转化障碍，如强免疫原性和高毒性，以及抗药物抗体的产生，这种协同免疫治疗的组合策略仍具有巨大的发展潜力。

双载荷ADCs可实现将细胞毒素和免疫刺激剂整合到单个分子中，旨在通过激活免疫系统充当免疫激活剂来创造肿瘤缩小的条件，实现协同效应。Liu等人开发了一种双载荷ADC，将传统细胞毒性载荷MMAF与免疫调节性TLR7/8激动剂咪喹莫特（IMQ）结合在CD276 mAb上，通过诱导肿瘤细胞死亡和刺激免疫细胞浸润实现抗肿瘤效果。他们通过使用再桥接DBM连接子将mAb与MMAF连接，随后使用膦-叠氮化物连接子进行IMQ偶联，构建了ADC（CD276 mAb-MMAF/IMQ）。对于通过位点特异性偶联的MMAF，DAR值为3至4，而IMQ的随机偶联显示异质结构，DAR为7至14。构建的双载荷ADC对CD276阳性肿瘤显示出高特异性，有效的肿瘤细胞死亡，明显的免疫细胞浸润以及肿瘤微环境中的细胞因子分泌。所有动物研究中的肿瘤负担显著减少，突显其作为TNBC靶向治疗的巨大潜力。

Meng等人还构建了免疫刺激性SPARCs，将TOP1i与TLR7激动剂1V209结合。在HER2同基因小鼠模型hHER2-MC38中，新型双载荷ADC（SPARC2-HER2-exatecan-1V209）导致小鼠反应增强，优于单载荷1V209或依喜替康的ADC。此外，一些研究探索了TOP1i与不同TLR7/8激动剂的组合，尽管具体结构尚未公开。这些双载荷ADCs通过协同作用机制在体外和体内促进增强的免疫原性细胞死亡和抗肿瘤反应，证明了这种组合策略的有效性。

此外，ADCs的载荷不限于细胞毒性药物。近年来，已探索了许多新型偶联物类型，如抗体-放射性核素偶联物（ARC）、抗体偶联细菌毒素（ATX）、抗体-siRNA偶联物（AOC）、抗体-细胞偶联物（ACC）和降解剂-抗体偶联物（DAC）。这些新型偶联物可能解决传统治疗的低靶向性和高脱靶毒性问题，展现出广阔的发展前景。

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结语

通过包括双特异性靶向、优化内化效率、共价结合技术和组合载荷设计在内的策略，这些新型ADCs为精准癌症治疗提供了多功能且有前景的解决方案。此外，还出现了多种功能增强型设计策略，包括提高靶向特异性的前抗体-药物偶联物、调节抗体效应功能或延长半衰期的Fc工程改造、改善递送和效率的纳米颗粒-ADC杂合体和多功能递送系统，以及最近开发的降低游离载荷毒性的载荷回收ADC技术。尽管仍存在免疫原性、耐药性和组织特异性调控等挑战，ADC的发展正处于变革性增长的边缘，并有望重塑癌症治疗的格局。随着对肿瘤生物学的深入理解和ADC设计的持续优化，我们正朝着实现真正有效、安全且个性化的癌症治疗迈进，最终为难治性恶性肿瘤患者带来新希望。

参考资料：

Recent advances in function-enhanced antibody-drug conjugates: Antibody optimization and payload combination. Acta Pharmacol Sin. 2026 Jul 17.