Mol Ther | 骨骼肌poly-GR驱动C9orf72相关ALS肌萎缩和神经肌肉接头损伤

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一类以运动神经元退行性变为主要特征的致死性神经退行性疾病。长期以来，ALS相关的肌肉萎缩多被认为是运动神经元退变和轴突去神经支配后的继发结果。然而，越来越多证据表明，骨骼肌并非疾病进程中的“被动受害者”，ALS相关致病蛋白在肌肉中的异常表达也可能直接破坏肌肉稳态和神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）结构，从而参与运动功能障碍的发生发展。

C9orf72基因六核苷酸重复扩增是ALS和额颞叶痴呆（FTD）中最常见的遗传因素之一。该突变可产生多种二肽重复蛋白（dipeptide repeat proteins，DPRs），其中富含精氨酸的poly-GR和poly-PR在神经系统中具有较强毒性。值得注意的是，C9orf72及其相关DPR并不只存在于神经系统，已有研究在C9orf72-ALS患者肌肉细胞和iPSC来源肌肉细胞中检测到DPR蛋白。然而，DPR蛋白在骨骼肌中的致病作用及其是否参与ALS进程，目前仍缺乏直接证据。

近日，上海科技大学李磊团队联合复旦大学附属华东医院郑拥军团队、广州医科大学陈文兵团队在Molecular Therapy发表题为 C9orf72-associated poly-GR in skeletal muscle leads to neuromuscular junction deficits and muscle atrophy 的研究论文。该研究发现，C9orf72相关DPR蛋白poly-GR在骨骼肌中的表达足以诱发小鼠运动功能障碍、肌肉萎缩和神经肌肉接头损伤；其机制涉及poly-GR促进MuSK降解以及激活整合应激反应（ISR）抑制蛋白翻译。进一步地，MuSK激动抗体X-17和ISR抑制剂ISRIB可分别改善神经肌肉接头功能和肌肉病理，为C9orf72-ALS的肌肉靶向治疗提供了新思路。

为探究DPR蛋白在骨骼肌中的作用，研究团队构建了AAV9介导的骨骼肌特异性表达模型，在新生小鼠四肢肌肉中表达50次重复的poly-GR或poly-PR。结果显示，骨骼肌中表达poly-GR的小鼠在5月龄时出现明显运动功能障碍，表现为四肢抓力下降和转棒实验表现变差；而poly-PR表达并未引起类似表型。这一结果提示，虽然poly-GR和poly-PR在神经系统中均具有毒性，但其在骨骼肌中的致病效应存在显著差异，DPR毒性具有细胞类型和组织环境依赖性。

进一步分析发现，poly-GR表达显著破坏神经肌肉接头结构。与对照小鼠相比，poly-GR小鼠胫前肌中的乙酰胆碱受体（AChR）簇出现碎片化，AChR信号强度和面积下降；同时，标记运动轴突和突触小泡的神经丝及synapsin-1信号也显著减少，提示骨骼肌内poly-GR不仅损伤突触后结构，也可伴随突触前运动神经末梢异常。研究团队还在前肢肌肉中观察到类似NMJ缺陷，说明这一现象并非局限于单一肌肉类型。

除了NMJ异常，poly-GR表达还导致明显肌肉萎缩。poly-GR小鼠肌纤维横截面积显著降低，肌纤维大小分布向小直径偏移，并出现中央核比例升高等肌肉病理改变。研究团队进一步排除了AAV9外泄转导中枢神经系统的可能性：肌肉注射后，脑和脊髓中几乎检测不到AAV介导的GFP信号，脊髓运动神经元也未见明显转导。因此，这些结果支持骨骼肌内poly-GR可细胞自主地诱发肌肉和NMJ病理，而并非由中枢神经系统直接转导所致。

为了阐明poly-GR如何破坏NMJ，研究团队关注了维持神经肌肉接头形成和稳定的关键受体MuSK（muscle-specific tyrosine kinase）。 结果显示，poly-GR表达显著降低骨骼肌中MuSK蛋白水平。在细胞实验中，poly-GR可与MuSK相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径促进MuSK降解，从而降低MuSK蛋白稳定性。这为poly-GR诱导突触后AChR簇破坏和神经肌肉传递异常提供了机制解释。

研究团队进一步测试了MuSK激动抗体X-17的治疗效果。X-17给药后可富集于NMJ区域，并显著改善poly-GR小鼠的抓力表现；在组织学层面，X-17明显缓解AChR簇碎片化，恢复突触后信号强度和面积，同时改善突触前区域缺陷。电生理实验也显示，X-17可恢复poly-GR小鼠受损的神经肌肉传递功能。值得注意的是，X-17并未显著改善肌肉萎缩，提示poly-GR导致NMJ损伤和肌肉萎缩可能分别依赖不同机制。

随后，研究团队通过免疫共沉淀-质谱分析寻找poly-GR在骨骼肌中的互作蛋白。结果显示，poly-GR相关蛋白显著富集于核糖体和蛋白翻译相关通路。结合嘌呤霉素掺入实验，研究人员发现poly-GR显著抑制细胞和骨骼肌中的新生蛋白合成。进一步机制研究显示，poly-GR激活整合应激反应（integrated stress response，ISR），提高eIF2α磷酸化水平，从而抑制整体蛋白翻译。该结果提示，蛋白合成受阻可能是poly-GR诱导肌肉萎缩的重要原因。

为验证这一通路的治疗潜力，研究团队使用ISR抑制剂ISRIB进行干预。ISRIB可恢复poly-GR细胞中的蛋白翻译水平；在小鼠体内，ISRIB治疗显著改善poly-GR小鼠抓力和转棒表现，增加肌肉蛋白合成，扩大肌纤维横截面积，并缓解肌肉萎缩。令人关注的是，ISRIB不仅改善肌肉病理，还恢复了MuSK蛋白水平，缓解AChR簇碎片化及突触前、突触后结构异常，并改善神经肌肉传递功能。这说明ISRIB可能通过恢复蛋白翻译和MuSK稳态，同时作用于肌肉萎缩和NMJ损伤两个关键病理环节。

综上，该研究证明了C9orf72相关poly-GR在骨骼肌中的致病作用，揭示了骨骼肌在ALS进程中并非单纯的下游受损组织，而是可主动参与疾病发生发展的重要病理场所。研究提出了一个新的机制模型：poly-GR一方面通过促进MuSK降解破坏神经肌肉接头稳定性，另一方面通过激活ISR抑制蛋白翻译，引发肌肉萎缩；靶向MuSK信号或ISR通路可在不同层面改善poly-GR诱导的神经肌肉病理。 这一发现拓展了人们对C9orf72-ALS发病机制的理解，也提示未来ALS治疗策略或需同时关注运动神经元和骨骼肌两个部分。

上海科技大学谭馨懿博士研究生、广州医科大学孙双双博士，复旦大学附属华东医院闫雨晴硕士为论文共同第一作者。上海科技大学李磊、广州医科大学陈文兵、复旦大学附属华东医院郑拥军为共同通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2026.07.002

制版人：十一

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