上海
构建最小基因组微生物，既是探索生命核心代谢途径、解答“维持生命所需最小基因集合”基础命题的理想模型，也是合成生物学中打造高效工业生物制造底盘的关键路径。目前主流的“自上而下”基因组缩减策略，受限于必需基因注释不全、合成致死效应与功能冗余基因广泛存在等问题，大片段基因组删除往往反复失败，只能通过逐段试错、多轮迭代的方式缓慢推进，效率与深度均面临长期瓶颈。
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室CRISPR与古菌生物学研究中心佘群新教授、冯旭研究员团队在Advanced Science在线发表题为CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction的研究论文。团队创新性提出名为CREAT的多同源臂模板CRISPR基因组修剪策略，将CRISPR靶向基因组切割与“同源臂步移”技术创新融合，建立“必需区分类-合成式替换”的两步式工作流，在古菌模式生物中实现20.8%的基因组缩减，并成功拓展至多种细菌，为系统性、高效构建微生物最小基因组提供了通用新工具。
为解决传统删除方法“试错成本高、分区效率低”的核心痛点，研究团队受真核生物VDJ重组产生抗体多样性的机制启发，开发了同源臂步移（Homology arms walking, HA walking）技术。该技术通过设计串联排列的多同源臂作为修复模板，在CRISPR靶向切割产生DNA双链断裂后，靶向位点两侧的不同组合的同源臂与基因组发生随机同源重组，可在单次实验中产生覆盖所有缺失组合的突变体库，从而系统划分目标区段内的非必需区、必需区与准必需区。这一方法将多轮功能验证整合为一步化的多重分析，不仅大幅提升了分区效率，还能同步筛选出生长优势更优的突变株，为获得性能优良的精简基因组菌株提供了天然便利。
随后基于同源臂步移获得的精确必需基因信息，研究团队建立了完整的CREAT基因组精简核心流程：将鉴定得到的必需/准必需基因组装为人工合成的同源臂模块，通过一步基因组替换，将原本分散在必需区之间的非连续非必需序列一次性精准删除，直接获得深度修剪的基因组突变株。系统实验验证表明，CREAT策略同时适用于古菌与细菌，兼容内源I型CRISPR、外源Cas9等多种编辑系统，具备良好的普适性与多轮迭代能力。
图1. CREAT基因组精简策略示意图
总体而言，CREAT策略突破了传统基因组缩减“逐段试错、多轮迭代”的技术局限，将多轮功能验证整合为一步化的多重分析，显著提升了最小基因组构建的效率与系统性。该技术不仅为不同微生物底盘的最小基因组理性设计与快速构建提供了通用方案，也为合成生物学底盘细胞的工程化改造提供了全新工具。
论文由山东大学微生物技术国家重点实验室作为第一完成单位和通讯作者单位。博士后袁冠华为论文第一作者，冯旭研究员与佘群新教授为共同通讯作者。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.76042
制版人：十一
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