ENCODE项目第四阶段终版成果发布：构建接近完整的人类与小鼠基因组功能元件参考图谱

人类基因组包含约30亿个核苷酸，承载着构建生命所需的遗传信息。自2003年人类基因组参考序列草图公布后，解析基因组中功能元件的身份与作用机制便成为生命科学的核心任务之一。为此，美国人类基因组研究所（NHGRI）和欧洲生物信息研究所（EMBL）于同年启动了DNA元件百科全书（ENCODE）计划，旨在系统鉴定和表征人类基因组中所有基因及调控元件。经过二十多年持续攻关，ENCODE项目先后经历四个阶段，从最初聚焦1%基因组区域，到借助高通量测序技术实现全基因组覆盖，并拓展至小鼠等模式生物。

近日，ENCODE项目联盟在bioRxiv预印本平台发布了第四阶段（ENCODE 4）的综合性研究成果，标志着这一国际协作项目迎来最终收官；在该阶段，研究团队系统性地完成了对人类和小鼠基因组功能元件的全面编目与表征，为理解基因调控提供了迄今最广泛的基础参考。该阶段累计完成超16,000项全基因组检测，覆盖了超5,000种生物样本，包括人类和小鼠主要解剖组织与原代细胞、常见细胞系、发育时序样本及扰动模型样本，构建了涵盖基因、调控元件及其相互作用的三层参考图谱，为理解人类与小鼠基因组功能提供了系统框架。同时，研究构建完整DNA 元件数据库，其
注释了数以万计的基因、数十万种转录本、数百万调控元件和数千万次调控元件相互作用。研究团队将这些结果汇编成一套可开放访问、标准化的DNA元件百科全书，为基因组医学、发育生物学、进化遗传学奠定基础数据框架。

基因调控元件的全面鉴定与注释

ENCODE 4在基因调控元件识别与功能注释方面取得了里程碑式进展，其最核心的成果之一是实现了对染色质可及性位点的近乎饱和式覆盖。在ENCODE4，研究团队将DNase I超敏感位点（DHS）图谱扩展至4,159种不同的细胞类型、组织类型和细胞状态，样本覆盖度较前期扩大5.5倍，尤其增加了人胎儿组织、成年脑和免疫细胞的数据，结合批量及单细胞ATAC-seq，最终构建了包含530万个高置信度染色质可及性位点的人类DHS目录。随着样本量激增，新DHS的检出率急剧下降，与外部两万余套公共数据集交叉比对后证实该目录基本饱和，未来单次实验平均仅能新增约50个位点。

图1. ENCODE 4测序和样本

在细胞类型特异性方面，每个参考DHS平均在25种细胞环境中开放，仅约0.5%的元件在超80%样本中普遍存在，后者多为启动子或染色质调控因子CTCF结合位点。相关组织类型的细胞具有相似的DHS图谱，而恶性肿瘤细胞则频繁激活与其谱系来源不匹配的DHS。

在组蛋白修饰层面，研究团队对约450种细胞/组织背景进行了H3K27ac、H3K4me1等多种修饰的ChIP-seq或Mint-ChIP检测，并结合CTCF谱，利用ChromHMM和Segway等隐马尔可夫模型系统注释了全基因组的调控活性状态，系统鉴定增强子、启动子、沉默子，以及远距离强抑制单元“超级沉默子”。

转录因子检测规模从500种扩增至1,100种，覆盖约70%人类转录因子；针对缺少特异性抗体的锌指蛋白，采用内源表位标签策略完成729种蛋白结合图谱，在HepG2、K562细胞系中分别识别8万、4万个转录因子区域，同时发现了转录因子共结合模块（如AP-1）的细胞特异性差异。此外，通过PRO-cap等新生转录技术，在 215 份人类样本中鉴定了715,296个转录活性调控元件，并证实启动子与增强子共享核心起始序列特征；CTCF、ZNF143等因子影响转录起始方向；单向转录元件进化更年轻、序列约束更弱。进一步，研究团队整合DHS、组蛋白修饰模式、TF结合、新生转录数据，将240万DHS划分为7类候选顺式调控元件（cCRE）；其中启动子样和增强子样cCRE在报告基因实验中活性最高，且仅在对应细胞类型发挥功能。

图3. 预测性DNA序列模型与统一的基序解读

ENCODE 4系统开展了约600项大规模功能表征实验，验证了数万个调控元件的真实功能活性，并区分了报告基因检测与CRISPR筛选的调控活性检测阈值差异，明确了染色质开放状态、蛋白结合对调控功能的约束作用。此外，研究团队训练了碱基分辨率深度学习模型（ChromBPNet/BPNet）分析ChIP-seq、染色质可及性及报告基因数据，整合并去冗余构建了包含3,384个非冗余DNA基序的统一目录，该目录囊括了其他主流数据库中的大部分基序，并新增了大量锌指蛋白基序、染色质状态调控因子基序以及协同结合基序。

图5. 转录多样性驱动因素

通过等位特异性分析与合成报告基因实验，ENCODE 4评估了150万常见/低频非编码变异，其中10%具显著等位基因效应；进一步整合eQTL和深度学习模型，预测了1,000万个变异效应，并构建变异-功能综合评分（cV2F），该评分预测人类复杂疾病位点AUPRC达0.82，显著提升多祖先人群精细定位精度。

基因与转录本的扩展注释

ENCODE 4的第二个核心目标是构建并完善基因、基因表达、转录本异构体多样性以及转录本稳定性全景图谱。

在基因注释方面，ENCODE 4捕获长读长RNA测序完善GENCODE基因注释集，新增17,931个全新人类lncRNA基因（140,268个转录本）和22,784个新小鼠lncRNA基因（136,169个转录本）。这些新注释的lncRNA具备典型转录单位的特征，但因表达高度局限于特定细胞群体而难以被常规RNA-seq检测；大量疾病相关变异、“孤独”启动子与增强子均定位其上，大幅提升人鼠同源疾病相关lncRNA的数量，同时为非人灵长类转录组注释提供预测依据。

ENCODE 4还利用长读长RNA-seq对超400个组织与发育样本进行全长转录组测序，全面扩充转录本异构体表达图谱。在GENCODE v40中，87%人类蛋白编码基因存在全长转录本，其中89%存在多种异构体。研究共定位超20万个polyA+转录本，35%相比GENCODE v40具有新的剪接方式。通过将转录本按转录起始位点（TSS）、外显子连接和转录终止位点（TES）进行分类，发现44%的蛋白质编码基因的转录多样性集中在单一维度。

RNA稳定性方面，研究利用Bru-seq和BruChase-seq技术，在16个细胞系中测量转录后不同时间段的RNA降解速率，绘制全基因组RNA周转速率图谱。不同基因、不同时间区间、不同细胞类型间RNA周转速率差异极大，转录因子中尤甚；其中，KLF6和ALKBH5分别在两个时间点和细胞系中始终属于最不稳定和最稳定的转录本之一。同一基因不同异构体降解速率存在显著区别，提示转录后选择性调控广泛存在。此外，研究还生成了286种RNA结合蛋白的eCLIP图谱和536个敲除后的RNA-seq数据，为理解RNA结合蛋白在转录本生命周期中的作用提供了系统资源。

图6. 转录本在不同时间及细胞模型中的稳定性

调控元件与基因之间的相互作用

ENCODE 4第三大核心研究方向是绘制基因与基因调控元件之间的物理互作及功能互作图谱。

研究团队开发intact Hi-C技术，完成100种人细胞/组织高分辨率染色质互作图谱，其中包含K562、HepG2、HCT-116标准细胞系高密度互作图谱，单套图谱测序reads量约900亿；同时完成40名供体来源的40个淋巴母细胞系（LCL）测序，总reads量达3,500亿，鉴定出约100万个点对点染色质环，连接138,049个独特环锚点。

借助蛋白降解扰动实验，研究团队分析了敲除CTCF、黏连蛋白、RNA聚合酶II（RNA Pol II）、AP1等8种核心调控因子时染色质环的变化。结果显示，85%染色质环依赖黏连蛋白、78%依赖CTCF，但仍存在部分不依赖二者的环结构。RNA Pol II锚定的环对黏连蛋白依赖性更强，AP1基序锚定的环则不依赖CTCF与黏连蛋白，提示存在多种环形成机制。

图7.物理相互作用的高分辨率图谱

通过结合intact Hi-C与ChIA-PET技术，研究构建覆盖超100种人类细胞、组织的物理互作数据集，包含1,100万个环（分辨率小于100 bp）；绝大多数长程调控互作与物理环高度对应，表明物理相互作用是调控功能的基础。在此基础上，研究团队训练了ENCODE-rE2G预测模型，预测全基因组范围内的功能调控互作。平均单个基因存在5.9个远端调控连接，单个远端调控元件可作用于1.6个基因。该模型预测的75%互作发生在目标启动子100 kb以内；管家基因对远端增强子不敏感，邻近增强子簇存在超加性协同激活效应。研究进一步拓展模型适用场景，仅依托1458个ENCODE DNase-seq数据，即可在无Hi-C样本中预测出超9,200万个调控互作。

小鼠研究与跨物种功能保守性

小鼠是极具价值的模式生物，能够开展诸多无法在人体中实施的实验研究。因此，注释小鼠的基因、调控元件以及二者间互作关系，是ENCODE 4第四大核心研究方向。

ENCODE 4在小鼠研究中纳入578个样本，鉴定出260万个小鼠DHS，完整度约61%。研究选取出生后7个时间节点关注了13种组织的染色质可及性变化，并在5个核心组织中进行批量及单细胞RNA-seq。结果显示，18%基因为产前特异性表达基因，8%为出生后特异性表达基因，同时发现大量发育阶段依赖的异构体转换和细胞类型特异性调控元件。

跨物种保守性分析，共识别出55万个具有序列保守性的人类-小鼠共享DHS，占人类DHS总量10%。通过对220万对序列匹配元件和约1.8亿对启动子侧翼元件的系统分析，核心数据集筛选出30万对功能保守性调控元件对，扩展数据集得到310万对；启动子近端元件保守性更强，远端增强子组织特异性更高。

图9. 人类与小鼠之间基因调控元件的功能保守性

转座子是人、小鼠基因组中调控元件重要的进化起源。ENCODE 4注释结果显示，约35%的人DHS、 33%的cCRE与转座子序列显著重叠；约37%的人谱系特异性cCRE和28%的小鼠谱系特异性cCRE源自转座子插入。此外，研究团队开发古基因组Hi-C技术（PaleoHi-C），证实5.2万年前猛犸象皮肤样本仍保留保守染色质环；跨七类两侧对称动物/物种比对显示，脊椎动物特有的CTCF-黏连蛋白环挤出机制在无脊椎动物中不存在。

数据共享与配套工具平台

ENCODE项目为方便科研人员访问和利用其海量数据，构建了多层次、多功能的资源平台。核心数据通过ENCODE门户网站（https://www.encodeproject.org/）集中发布，支持结构化元数据检索，覆盖项目各阶段所有数据集。可视化方面，网页工具 Regulome支持DHS目录查询、SCREEN工具可检索cCRE注释及跨细胞类型比较、Factorbook整合转录因子结合信息等。为适配智能化研究需求，项目搭建专属MCP服务器，支持人工智能系统自动挖掘与解析 ENCODE 海量数据。

参考文献：

https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.06.731365v1

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