R2逆转座子介导大片段基因整合：研究进展与应用展望

原文发表于《科技导报》202 6年第11期《R2逆转座子介导的大片段基因整合技术新进展》

基因编辑是通过特定技术手段，对生物体基因组的特定目标位点进行精准修饰，进而调控其遗传信息与表型特征的技术过程。其中，大片段基因整合技术可在生物体基因组中实现大片段外源DNA的精准插入或替换，为重大疾病的创新治疗方案开发提供了核心技术支撑。《科技导报》邀请中国科学院动物研究所器官再生与智造全国重点实验室、中国科学院大学、北京干细胞与再生医学研究院李伟研究员团队撰写文章，从该技术的历史起源切入，系统梳理了其发展脉络，并剖析了当前大片段基因整合技术存在的技术瓶颈。进一步介绍了R2逆转座子的结构与靶标引发逆转录的整合机制，综述了研究进展并总结了R2逆转座子介导的大片段整合工具的技术突破以及应用前景，为其在基因治疗领域的应用提供理论启发与实践参考。

基因编辑技术是一类通过精准识别和修饰生物体基因组外源脱氧核糖核酸（DNA）序列，实现遗传信息与表型特征改变的生物技术。大片段基因整合技术是基因编辑领域的重要分支，可以实现外源大片段DNA在基因组特定位点的稳定整合，为疾病诊疗提供创新解决方案。

随着生命科学研究的深入及医学应用需求的升级，大片段整合技术历经从依赖同源重组（HR）的传统模式向非DNA双链断裂（DSB）依赖的新型整合路径的转变，供体形式也从单一的DNA供体拓展至更适配医学应用场景的核糖核酸（RNA）供体。这一技术演进不仅突破了早期HR技术在整合效率上的局限，更推动了基因治疗从理论探索向临床转化的跨越。

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大片段整合技术的历史与发展

大片段整合技术是一种能够将大片段DNA精准整合至基因组特定位置的基因编辑技术。大片段整合技术的起源可追溯至HR的发现与应用。1982年，Folger等在哺乳动物细胞显微注射外源DNA体系中，证实导入的质粒分子间可自发发生HR。1985年，Smthies等利用电穿孔法实现了外源DNA在哺乳动物细胞内源基因座（人β−珠蛋白位点）的定点整合。随后，Wong等从分子层面阐明同源重组介导外源基因定点整合的作用机制。20世纪90年代，Rouet等与Sargent等借助其特异性切割DNA的特性引发DSB，进而激活细胞修复机制，显著提升HR效率。

1996年，基因编辑领域迎来新突破。科学家利用锌指蛋白对DNA的特异性识别能力，成功构建出锌指核酸酶（ZFNs）。这一可编程核酸内切酶的诞生，打破了传统技术在靶向切割位点上的限制，极大地拓展了HR技术的应用范围。此后，研究人员借鉴类似设计思路，开发出转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）。TALENs在设计上更具灵活性，为基因整合的精准性提供了更有力的选择。

规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）系统的问世，标志着HR介导的大片段精准整合技术迎来又一次革命性突破。2012年，Jinek等在体外解析了酿脓链球菌来源的CRISPR/Cas9系统（SpCas9）的功能，将tracrRNA−crRNA双RNA结构简化为单引导RNA（sgRNA），并证实该系统可通过改变其中20 nt的间隔序列实现可编程基因编辑。随后，Cong等与Mali等分别成功将其应用于哺乳动物细胞编辑。该体系可在靶标位点高效产生DSB，极大提高了HR的效率，降低了操作难度，革新了大片段精准整合领域（图1（a））。

为改善传统技术依赖DSB可能带来的弊端，研究逐步聚焦于CRISPR/Cas9系统的功能改造。该系统的DNA切割功能由HNH和RuvC双结构域协同完成，通过对H840A、D10A等关键活性位点的定点突变，可获得2种重要功能变体。将这2种功能变体与效应蛋白融合，能够开发新型基因编辑工具，从而绕过DSB修复过程，显著降低Indel频率。Anzalone等成功开发了先导编辑技术（PE）。该技术能够高效实现靶向位点的片段插入、缺失及碱基替换，尤其在100 bp以内的小片段整合中表现出显著优势。Anzalone等和Pandey等进一步将PE系统与位点特异性丝氨酸整合酶Bxb1偶联，研发出PASSIGE技术。该技术实现了超过10 kb DNA片段的精准整合，并通过定向进化策略显著提升了整合效率（图1（b））。Yarnall等采用类似策略独立开发的PASTE技术，成功实现了最高36 kb DNA的大片段基因组整合，为基因治疗领域的大片段递送提供了重要技术支撑。

在先导编辑系统中，研究人员利用了RT以RNA模板合成DNA的特性，实现了对基因组序列的整合，这为摆脱传统编辑技术对DNA供体的依赖开辟了全新思路。因此，研究者将目光转向自然界中天然存在的逆转座子元件。其中，R2逆转座子是近年来开发新型大片段整合技术的研究焦点（图1（c））。

图1 大片段整合技术实现路径

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R2逆转座子的开发与应用

R2逆转座子是一类可特异性整合到核糖体DNA（rDNA）中的可移动元件，最早由Dawid等与Roiha等在果蝇的28S rDNA基因位点中鉴定。

R2逆转座子由蛋白组分与RNA组分2部分组成。其中蛋白组分是一个多功能R2蛋白，而RNA组分则是一条可翻译出R2蛋白的mRNA，其除了蛋白表达框，还包含有两端的非编码区（UTR）。R2逆转座子在进化谱系中可进一步划分为R2−A、R2−B、R2−C、R2−D 4个分支，各分支之间的核心差异主要体现在N端ZF基序的数量上（图2）。

图2 R2逆转座子的组成

R2逆转座子特异性整合到rDNA的特性避免了随机整合带来的风险，因此十分有利于开发成为可全RNA递送的靶向基因整合工具。

2.1 R2逆转座子的整合机制

在逆转座过程中，R2蛋白的多个功能结构域协同发挥功能，并与R2 RNA形成复合物，通过有序的多步反应实现自身序列的精准整合。

整合开始前，R2蛋白的NTE−1结构域参与识别并结合R2 RNA的3' UTR，从而形成核糖核蛋白复合物。随后该复合物特异性识别rDNA插入位点附近的2段保守DNA基序。第一段保守基序（RUM或Drr）位于逆转座子插入位置上游被R2的DNA结合结构域的ZF基序、Myb基序与RT结构域共同识别。另一段保守基序（RASIN或Dcr）则涉及插入位点的切割，其在整合过程中靠近R2蛋白的核酸内切酶结构域并被解旋，随后由R2蛋白的内切酶活性切割第一条靶DNA链，暴露出3'羟基。

第一条链切割后，R2蛋白的RT启动逆转录过程，利用切口处暴露的DNA的3'羟基与R2 RNA模板开始第一条cDNA链的合成，这一过程被称为靶标引发的逆转录（TPRT）。

第一条cDNA链的合成完成后，R2蛋白的核酸内切酶结构域启动第二条DNA链的切割。逆转录完成后，3' UTR被移除，5' RNA与蛋白形成的复合物开始激活第二条链的切割。随后第二条cDNA链起始合成，最后通过DNA修复完成整个整合（图3）。

尽管已经有不少针对R2逆转座子整合机制的研究，但仍存在一些细节有待解析。对R2逆转座子的独特整合机制的进一步理解为大片段基因整合工具开发提供了新的视野。

图3 R2逆转座子的TPRT机制示意

2.2 R2逆转座子的研究进展

R2逆转座子整合的特异性与形成RNA中间体的特性，使其成为开发全RNA形式的精准靶向基因整合工具的有力候选系统。2019年，Kuroki−Kami等就尝试将来源于青鳉鱼的R2Ol逆转座子用于在斑马鱼中实现位点特异性整合，并且在斑马鱼生殖细胞中实现高效的EGFP整合（高达95%），但R2Ol逆转座子在哺乳动物细胞上R2Ol逆转座子的表现并不理想。2023年，Wilkinson等针对R2Bm做了结构解析，阐释了R2Bm逆转座过程中TPRT起始的分子机制，同时在体外证明了R2Bm可通过Cas9的重编程性质实现对非28S rDNA位点的靶向。同期，Luan等鉴定并解析了R2Bm逆转座过程中R2 RNA组分中5' RNA与3' UTR的调控功能。

2024年，Zhang等与Chen等各自独立开发了可在哺乳动物细胞上实现全RNA介导的靶向基因整合的R2工具。其中，Zhang等开发了精确RNA介导的转基因插入（PRINT）技术。而Chen等通过系统的工程化改造开发的en−R2Tg工具，具有极高的靶向整合特异性（高达99%）和极好的整合精确度，约90%的5'端被精确整合到28S rDNA预定位点。2025年，Fell等利用SpCas9H840A与R2Tocc逆转座子在哺乳动物细胞中实现了一定程度的R2的重编程基因插入。 随后，Edmonds等解析鸟类R2逆转座子（R2Tg）的结构与生化机制，可完成高精准度的靶向基因插入。2026年，McIntyre等进一步阐明R2逆转录子介导基因插入的分子机制，系统揭示ATR−Polθ、53BP1−Shieldin−CST−Polα及CtIP−MRN 3条宿主修复通路分别调控微同源连接、截短插入与全长精准整合。

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结论与展望

相较于CRISPR同源重组，PE结合重组酶等DNA依赖型大片段基因整合工具，R2逆转座子以全RNA递送模式为核心，摆脱了外源DNA导入带来的细胞毒性与免疫原性问题，具有易递送、定点整合安全性高等独特优势，适用于原代免疫细胞改造与体内基因编辑研究。然而，目前这类工具仍存在整合位点固定、可编程性不足、大片段整合易形成截短插入产物、整体整合效率偏低等缺陷。

R2逆转座子工具有望开发在体功能基因回补、在体生成嵌合抗原受体T细胞（CAR−T）细胞等全新的疾病治疗方法，首先，对于许多单基因遗传病而言，导致疾病发生的致病点突变往往并不唯一，相同表型可能存在不止一个致病点突变。相较而言，利用R2逆转座子编辑工具回补正常功能性基因，有望构建通用基因治疗方案。此外，CAR−T细胞疗法，目前已经在治疗血液系统的恶性肿瘤中展现出显著的疗效。R2逆转座子的全RNA形式，可通过非病毒载体进行递送，无需体外细胞改造与病毒包装流程，有望实现在体内直接生产CAR−T细胞。并且相较于单纯mRNA瞬时递送，R2逆转座子的靶向DNA整合可实现CAR分子的持续表达。并且全RNA递送模式无外源DNA与病毒骨架掺入，显著降低免疫原性，制备流程精简且成本可控。R2逆转座子作为一类全新的基因整合工具，通过全RNA递送可实现精确的基因整合，从而为开发全新的疗法提供了一个可扩展的生物技术平台。现有的R2逆转座子工具在哺乳动物细胞上的基因整合效率仍有很大的提升空间，而随着未来对R2逆转录转座子结构、整合机制的深入解析，有望利用这种独特的可移动元件设计出更高效的、全RNA递送与可编程的基因整合工具。

本文作者：汪彧泽、毛邦炜、骆胜球、陈阳灿、李伟

作者简介：汪彧泽，中国科学院动物研究所器官再生与智造全国重点实验室、中国科学院大学，博士研究生，研究方向为基因编辑技术的开发与应用；李伟（通信作者），中国科学院动物研究所器官再生与智造全国重点实验室、中国科学院大学、北京干细胞与再生医学研究院，研究员，研究方向为哺乳动物工程生物学技术平台，哺乳动物器官再生修复机制与技术，重大疾病生物治疗新方法。

文章来 源 ： 汪彧泽, 毛邦炜, 骆胜球, 等. R2逆转座子介导的大片段基因整合技术新进展[J]. 科技导报, 2026, 44(11): 24−32.

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