Nature Communications | 江南大学与厦门大学团队合作实现胞内人工酶组装并催化不对称曼尼希反应

设计人工酶来催化自然界没有的反应，是生物催化领域的一个前沿方向。把非天然的催化辅因子装进蛋白质空腔里，就能创造出全新的催化活性。但活细胞内部环境复杂，各种亲核物质和氧化还原过程很容易干扰辅因子的稳定性和蛋白的正确折叠，所以在细胞里直接组装人工酶并让它高效工作，特别是实现高立体选择性的不对称转化，一直是一件很困难的事。2026年7月2日，江南大学生命科学与健康工程学院周志教授团队和厦门大学化学化工学院王斌举教授团队合作在《Nature Communications》上发表了题为“Intracellular assembly of artificial enzymes for cytoplasmic enantioselective Mannich reactions”的研究论文。他们发展了一种在大肠杆菌细胞质内通过共价键快速组装人工酶的方法，并且利用这种人工酶在细胞内催化了非天然的不对称曼尼希反应，产物的对映选择性最高能达到90%以上。

研究团队选用了LmrR蛋白作为支架，这是一个来自乳酸菌的多药耐药调控蛋白，内部有一个比较大的疏水空腔。他们在蛋白的第57位引入了一个半胱氨酸残基，同时合成了一种含有二级胺结构的小分子催化辅因子。把表达该突变体蛋白的大肠杆菌细胞和这个辅因子放在一起孵育，辅因子就能穿过细胞膜进入细胞内部，和蛋白口袋里的半胱氨酸巯基形成二硫键。质谱分析确认，这种共价连接在短短10分钟内就能完成，而且不需要对细胞做任何特殊处理。带有二级胺催化中心的人工酶被命名为AM_L57C_SA，它能够通过烯胺活化机制催化环己酮与环状亚胺之间的曼尼希反应。初始变体在胞内就给出了14%的对映选择性和46%的产率，而对照实验表明，没有辅因子或者没有目标蛋白的情况下，反应几乎没有立体选择性。

为了进一步提高催化性能，研究团队采用了定向进化的策略。他们先用细胞裂解液代替纯化酶进行筛选，这样一来每天可以处理上百个突变体，大大加快了进化速度。研究团队解析了人工酶的晶体结构，根据结构信息选择活性口袋周围的六个氨基酸位点构建突变文库。经过四轮迭代筛选，最优变体AM_57SA_5.0在体外反应中给出了96%的对映选择性、大于20:1的非对映选择性以及超过99%的产率。将表达该变体的大肠杆菌细胞直接用于胞内反应时，同样获得了90%的对映选择性、大于20:1的非对映选择性和99%的产率。动力学测试显示，进化后变体的催化效率比初始变体提高了1.7倍。研究团队还考察了底物适用范围，无论是给电子基团还是吸电子基团取代的环状亚胺，都能被体系良好耐受，纯化酶和全细胞两种催化模式都给出了从良好到优秀的立体选择性和反应活性，一共获得了28个手性产物例子。不过他们也注意到，该人工酶对环状酮底物的结构有一定偏好，六元环酮反应效果最佳，而环戊酮、环庚酮和丙酮等底物的立体选择性会有所下降。

研究团队进一步验证了这套全细胞催化体系在制备规模上的实用性。他们利用表达AM_57SA_5.0的大肠杆菌细胞，通过离心收集和重新悬浮的循环操作，在800毫升的反应体系中经过四轮循环催化，从1毫摩尔规模的底物出发分离得到了1.06克手性产物，分离产率达到97%，对映选择性维持在90%。此外，将表达人工酶的细菌细胞制成冻干粉后直接用于反应，同样可以获得93%的对映选择性和99%的产率，这说明这种生物催化剂在使用便利性上已经可以和一些化学催化剂相媲美。

为了确证曼尼希反应确实发生在细胞内部而不是胞外溶液中，研究团队设计了一个对照实验。他们先用细胞催化一个产物容易通过离心分离的反应，然后将细胞沉淀和上清液分开，分别加入新的底物进行第二轮反应。结果显示，只有含有细胞的那一组能够高效生成目标产物（84%产率，89% e.e.），而上清液组几乎检测不到立体选择性（<5% e.e.）和反应活性（6%产率）。蛋白质量检测还表明，在长达12小时的胞内催化过程中，人工酶的二硫键连接始终保持完整，没有发生断裂。研究团队还考察了细胞内大量存在的谷胱甘肽对人工酶组装的影响，即便向反应体系中额外加入与辅因子等量的谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽，催化性能也没有受到明显影响。

在机理研究方面，厦门大学王斌举团队利用分子动力学模拟和量子力学/分子力学计算对人工酶催化曼尼希反应的立体选择性起源进行了深入分析。模拟结果显示，在四种可能的底物结合方式中，只有能够生成（R,S）产物的那一种结合构象能够保持稳定且合适的C1-C2反应距离，其他三种构象下底物要么距离过远，要么会从结合口袋中逃逸出去。计算还给出了C-C键形成步骤的能垒为5.2 kcal/mol，而后续的C-N键水解步骤能垒为20.4 kcal/mol。晶体结构和计算模型还揭示了蛋白口袋中的Arg10和Arg56残基通过氢键和盐桥网络稳定底物的关键作用，突变实验也证实了这两个残基对催化活性不可或缺。

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