BJP｜粉防己碱瞄准高血压性心衰：激活PGC-1α介导线粒体自噬，抑制心肌细胞铁死亡！（王梦阳团队—北华大学药学院）

2026年6月30日，北华大学药学院药理学系王梦阳副教授团队，联合 QU Health 基础医学系Ali H. Eid、浙江现代中药与天然药物研究院以及复旦大学药学院等，在British Journal of Pharmacology（中科院2区，IF=7.5）在线发表题为 “Fangchinoline alleviates hypertensive heart failure via PGC-1α/STAT6/PPARγ activation of mitophagy against ferroptosis” 的研究论文。PDF显示该文于2026年2月3日投稿，2026年5月10日修回，2026年5月31日接收。

该研究聚焦高血压相关心力衰竭中“线粒体质量控制—铁死亡”这一关键病理环节。研究者以血管紧张素 II（Ang II）诱导的小鼠高血压性心力衰竭模型和新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）损伤模型为基础，发现粉防己碱（Fangchinoline，FAN）能够改善 Ang II 诱导的心肌肥大、心功能障碍和纤维化。更重要的是，这种保护作用并不依赖降血压效应，而是与激活 PGC-1α 介导的线粒体自噬、调控 STAT6/PPARγ 通路并抑制心肌细胞铁死亡密切相关。

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【摘 要】

粉防己碱（Fangchinoline，FAN）是来源于粉防己（Stephania tetrandra）的一种具有生物活性的双苄基异喹啉类生物碱。已有研究提示其可能对血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II）诱导的高血压性心力衰竭（heart failure，HF）具有保护潜力，但其是否涉及线粒体自噬和铁死亡调控仍不清楚。本研究旨在评估 FAN 对 Ang II 诱导的心脏重构和心力衰竭的作用。

研究者通过连续4周输注 Ang II，在 C57BL/6 小鼠中建立高血压性心力衰竭模型，并在最后2周给予 FAN 干预。研究采用超声心动图评估心功能，通过组织学染色评价病理性心脏重构，并对心脏组织进行 RNA 测序，以探索 FAN 抗心力衰竭的作用机制。随后，研究利用分子对接、药物亲和反应靶点稳定性实验（DARTS）、细胞热迁移实验（CETSA）和表面等离子共振（SPR）验证 FAN 的潜在结合蛋白。在体外实验中，研究者采用新生大鼠心室肌细胞（NRVMs），考察 FAN 对细胞肥大、线粒体自噬和铁死亡的影响。

体内实验显示，FAN 处理显著改善心肌肥大、心功能障碍和心肌纤维化，且这些保护作用并不依赖降血压效应。机制上，FAN 可激活 PGC-1α，增强线粒体自噬，并抑制 STAT6-PPARγ 信号，从而抑制铁死亡并恢复氧化还原稳态。体外实验进一步表明，FAN 可减轻 Ang II 诱导的 NRVMs 肥大、活性氧（ROS）生成和线粒体膜电位去极化，并证实其可调节线粒体自噬和铁死亡相关标志物。

研究结果表明，FAN 可通过激活 PGC-1α 介导的线粒体自噬并调控 STAT6-PPARγ 通路，最终抑制心肌细胞铁死亡，从而缓解 Ang II 诱导的心力衰竭。这些发现为心力衰竭治疗提供了新的研究视角。

关键词：粉防己碱；心力衰竭；线粒体自噬；PGC-1α；PPARγ；STAT6

01

研究背景及科学问题

心力衰竭（heart failure，HF）是一种临床异质性很强的综合征，其病理生理机制复杂且受多因素影响，不同患者的病程进展和结局差异明显。心力衰竭给全球医疗系统带来沉重负担，影响人数巨大。随着人口老龄化和总人口增长，心力衰竭的发病率和患病率持续上升，尤其在65岁及以上成年人中，心力衰竭是住院的重要原因之一。流行病学研究普遍认为，在发达国家，高血压是心力衰竭最主要的病因驱动因素之一，常进一步发展为高血压性心脏病，表现为心肌结构和功能的适应不良性重构。因此，阐明心力衰竭的分子基础，并据此优化治疗策略，仍是当代心血管研究的核心问题。

在这一病理框架下，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）被认为是疾病进展的重要介质。RAS 过度激活可促进心室肥大，维持炎症信号，并加速纤维化重构，最终推动心功能障碍持续进展。血管紧张素 II（Ang II）是 RAS 的主要效应肽，可直接作用于血管平滑肌细胞产生强烈收缩效应，同时通过激活血管紧张素 II 1型受体（AT1 receptor）诱导心肌细胞病理性肥大。与此同时，Ang II 还可通过激活 NADPH 氧化酶促进活性氧（ROS）过量生成，引发氧化应激级联反应，破坏线粒体完整性和功能。线粒体损伤可表现为膜电位丧失、ATP 合成减少以及线粒体动力学异常，这些改变均直接参与心力衰竭的发生发展。尽管血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）和血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）等 RAS 抑制剂仍是临床治疗的重要基础，但部分患者仍存在治疗反应不佳，且长期使用可能受到咳嗽、血管性水肿等不良反应限制。因此，寻找能够减轻 Ang II 诱导心脏毒性的替代或辅助治疗策略具有重要意义。

在这一治疗背景下，植物、草药及其活性成分因可能调控心血管病理过程而受到越来越多关注。粉防己（Stephania tetrandra）是一种传统药用植物，含有粉防己碱（FAN）和汉防己甲素等双苄基异喹啉类生物碱，具有较突出的药理活性。这些化合物具有抗炎、抗氧化和心脏保护特性，因此成为转化研究中值得关注的候选分子。既往研究显示，汉防己甲素可通过下调瞬时受体电位香草酸亚型2（TRPV2）表达，减轻心肌缺血/再灌注损伤，并调节心肌细胞凋亡、钙稳态和线粒体功能。另有研究提示，汉防己甲素可通过抑制 MAPK/NF-κB 通路改善心室重构并抑制炎症信号。这些发现提示，来源于粉防己的生物碱可能具有多效性的心脏保护作用，也为进一步评价 FAN 在心力衰竭中的作用提供了理论依据。

进一步来看，FAN 已逐渐被证实具有广泛的药理活性和机制多样性。其生物学作用包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等。值得注意的是，FAN 可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/ULK1 通路诱导自噬，从而抑制结直肠癌生长。在心肌细胞稳态维持中，自噬，尤其是线粒体自噬，发挥着关键作用，可选择性清除受损线粒体。线粒体自噬失调会导致功能异常线粒体积累，促进 ROS 生成和脂质过氧化，最终诱发铁死亡。然而，FAN 是否能够通过调控“线粒体—铁死亡”轴来保护高血压性心力衰竭，目前仍未明确。

线粒体动力学调控真核细胞代谢，其中过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α（PGC-1α）是协调线粒体生物发生和氧化能力的重要因子。PGC-1α 通过调控维持线粒体功能所需的转录程序，直接影响心肌细胞在病理应激下的耐受能力。既往研究显示，神经氨酸酶1可通过 SIRT1/PGC-1α 轴调控心肌梗死后模型中的线粒体能量稳态和氧化应激，进一步说明该通路在心脏损伤中的功能重要性。另一方面，STAT6/PPARγ 信号级联也被认为参与心脏重构，相关证据提示巨噬细胞 p47phox 可通过 IL-4/STAT6/PPARγ 信号参与压力负荷诱导的心室重构。

然而，PGC-1α、STAT6 和 PPARγ 是否在心力衰竭中构成一个整合性调控轴，目前仍不清楚。为回答这一问题，本研究同时采用体内心力衰竭模型和体外心肌细胞损伤模型，系统评价 FAN 对心功能、心肌纤维化以及铁死亡相关关键通路的影响。研究结果显示，FAN 可抑制铁死亡，并首次将其心脏保护作用与 PGC-1α/STAT6/PPARγ 轴的调控联系起来。该整合性信号网络可能通过直接或间接相互作用，在 Ang II 诱导的应激条件下协调线粒体自噬和铁死亡反应。阐明这一相互关系不仅有助于深化对机制的理解，也为高血压性心力衰竭，尤其是对标准治疗反应不佳的患者，提供了多靶点治疗策略的研究基础。

02

重要发现及亮点

FAN 在体外筛选中显示出减轻心肌细胞肥大和炎症的潜力

为寻找 Ang II 诱导心力衰竭的潜在治疗候选物，研究者首先对包含70种天然产物的化合物库进行了初步筛选。筛选标准包括两方面：一是降低心肌肥大标志物 ANP 表达的能力，二是保持较低细胞毒性。在这些候选化合物中，FAN 既能明显抑制 ANP，又几乎不表现出细胞毒性，因此被筛选为具有潜力的候选分子。进一步检测显示，FAN 抑制 ANP 表达的 EC50 为 5.208 μM，维持细胞活力的 IC50 为 28.47 μM。

随后，研究者采用新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）构建体外模型，进一步验证 FAN 对心肌细胞的直接保护作用。MTT 实验显示，FAN 浓度在10 μM以内时无明显细胞毒性，细胞活力保持在90%以上，因此后续体外实验选用5 μM和10 μM作为干预浓度。经 FAN 预处理1小时后，再用 Ang II（1 μM）刺激细胞8小时或24小时。Western blot 结果显示，FAN 可剂量依赖性抑制 Ang II 诱导的 MYH7、ANP 和 BNP 蛋白上调。RT-qPCR 进一步显示，FAN 同样能够降低这些心肌肥大相关基因的 mRNA 水平。此外，FAN 还能逆转 Ang II 诱导的 Il1b、Il6 和 Tnf mRNA 上调。罗丹明-鬼笔环肽染色也证实，FAN 明显减轻 Ang II 诱导的细胞肥大。上述结果表明，FAN 可通过抑制心肌细胞肥大和炎症，对 Ang II 诱导的心肌细胞损伤发挥直接保护作用。

图1：粉防己碱（Fangchinoline，FAN）通过抑制新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）的肥大和炎症来保护心肌细胞。（a）基于天然产物库并使用血管紧张素 II（Ang II）处理的 NRVMs 进行筛选的策略示意图。候选化合物通过 ANP 检测和细胞活力实验进行鉴定。（b）热图显示化合物库对 ANP 的抑制率。细胞先用 Ang II（1 μM）处理24小时，随后用每种化合物（10 μM）处理24小时。（c）相对细胞存活率热图。细胞先用 Ang II（1 μM）处理24小时，随后用每种化合物（10 μM）处理24小时。（d）FAN 的化学结构。（e）MTT 实验显示 FAN 对 NRVMs 细胞的细胞毒性（n = 6 次独立实验）。（f）NRVMs 细胞中 MYH7、ANP 和 BNP 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（g）使用 ImageJ 对 F 图中蛋白条带强度进行定量分析。（h–j）RT-qPCR 显示 NRVMs 中 Myh7、Anp 和 Bnp 的 mRNA 水平。（k–m）RT-qPCR 显示 NRVMs 中 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平。（n）TRITC-鬼笔环肽染色（红色）显示 FAN 对 Ang II 诱导的 NRVMs 肥大反应的影响。切片用 DAPI 进行复染（蓝色）。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 改善 Ang II 诱导的小鼠心功能障碍和心脏重构

为评价 FAN 在体内对 Ang II 诱导心脏损伤的保护作用，研究者通过微量渗透泵连续4周输注 Ang II（1000 ng kg−1 min−1）建立小鼠模型。FAN 在 Ang II 输注2周后开始给药，剂量为20 mg kg−1和40 mg kg−1；缬沙坦（valsartan，Val，4 mg kg−1）作为阳性对照。

模型观察显示，Ang II 输注显著升高小鼠收缩压，并提高血清 Ang II 水平。然而，与未治疗模型组相比，FAN 对血清 Ang II 水平无显著影响，也未降低 Ang II 诱导的收缩压升高。这提示 FAN 的心脏保护作用并不依赖降压效应。尽管没有表现出降压活性，FAN 后续仍被证实可发挥明确心脏保护作用。

超声心动图分析显示，Ang II 诱导小鼠出现心力衰竭和心肌肥大，而 FAN 可剂量依赖性改善心功能，表现为射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）改善。FAN 还可显著减轻 Ang II 诱导的病理性心脏重构，具体表现为心脏重量/体重比下降以及等容舒张时间（IVRT）缩短。进一步分析显示，FAN 不影响心率，但可降低舒张末期左心室内径（LVIDd）、舒张末期室间隔厚度（IVSD）、舒张末期后壁厚度（PWD）、心脏重量/胫骨长度比、Tei 指数，并增加 E 波速度，整体提示其可改善心脏重构。血清生化检测显示，FAN 可降低 Ang II 诱导的 CK-MB 升高。代表性超声心动图和多普勒血流图也直观显示了上述心脏结构和血流动力学改善。总体来看，FAN 能有效改善 Ang II 诱导的心功能障碍。

图2：粉防己碱（FAN）减轻血管紧张素 II（Ang II）诱导的小鼠心功能障碍和心脏重构。（a）动物实验流程。（b）每周测量收缩压。（c）通过 ELISA 测定小鼠血清 Ang II 水平。（d，e）使用超声扫描成像系统测定小鼠射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）。（f）心脏重量/体重（HW/BW）的定量分析。（g）等容舒张时间（IVRT）的测量。（h）使用 ELISA 试剂盒测定小鼠血清 CK-MB 水平。（i）通过无创超声心动图测定小鼠心功能。（j）激光散斑对比成像（LSCI）监测心脏灌注。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；ns = 无显著性差异；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 缓解 Ang II 诱导的心肌肥大和纤维化

接下来，研究者通过大体心脏形态观察和麦胚凝集素（WGA）染色评估心肌肥大。结果显示，FAN 明显改善 Ang II 诱导的心肌肥大。组织病理学分析进一步证实，Ang II 诱导的心力衰竭模型具有心肌肥大、炎症和纤维化等关键病理特征。H&E 染色显示，FAN 可显著减轻 Ang II 诱导的心脏组织结构改变和心肌细胞增大。

病理性心肌肥大常与心肌间质纤维化并存，可表现为间质微瘢痕形成以及血管周围胶原纤维沉积。Masson 三色染色和天狼星红染色结果显示，FAN 能有效抑制胶原沉积和细胞外基质重构。因此，FAN 可通过抑制心肌细胞肥大和纤维化，减轻 Ang II 诱导的病理性心脏重构。

图3：粉防己碱（FAN）减轻血管紧张素 II（Ang II）诱导的心肌肥大和纤维化。（a）白色背景下新鲜心脏的代表性图片（比例尺 = 5 mm）。（b）心脏组织麦胚凝集素（WGA）染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。（c）心脏组织 H&E 染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。（d）心脏组织 Masson 染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。（e）Masson 三色染色显示的间质纤维化区域百分比定量。（f）Masson 三色染色显示的血管周围纤维化区域百分比定量。（g）心脏组织天狼星红染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。（h）天狼星红染色显示的间质纤维化区域百分比定量。（i）天狼星红染色显示的血管周围纤维化区域百分比定量。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比；ns = 与 CON 组相比无显著性差异。

FAN 下调心肌肥大相关标志物并抑制炎症因子表达

心力衰竭过程中，利钠肽系统会发生代偿性激活，并发挥一定心脏保护作用。Western blot 和 RT-qPCR 分析显示，Ang II 可通过上调 MYH7、ANP 和 BNP 等肥大相关标志物诱导心肌肥大，而 FAN 能剂量依赖性降低这些标志物的表达。ANP 免疫荧光染色也直接证实了心肌细胞肥大状态的变化。与此同时，mRNA 水平的同步下降进一步说明 FAN 对病理性心肌肥大具有保护作用。

慢性炎症可导致心脏结构逐渐受损，并最终促进心脏纤维化。对心脏炎症标志物的检测显示，Ang II 显著上调 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平，而 FAN 处理可有效抑制这一反应。因此，FAN 可通过直接下调肥大相关基因并抑制促炎因子，缓解病理性心脏重构。

图4：粉防己碱（FAN）改善血管紧张素 II（Ang II）诱导的小鼠心肌肥大和炎症。（a）心脏组织中 MYH7、ANP 和 BNP 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（b）使用 ImageJ 对 A 图中蛋白条带强度进行定量分析。（c）小鼠心脏组织中 ANP（绿色）免疫荧光代表性图像，细胞核用 DAPI（蓝色）复染。（d–f）通过 RT-qPCR 检测心脏组织中 Myh7、Anp 和 Bnp 的 mRNA 水平。（g–i）通过 RT-qPCR 检测心脏组织中 Il1b、Il6 和 Tnf 的 mRNA 水平。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 通过激活自噬通路缓解心力衰竭

为进一步探索 FAN 抵抗 Ang II 诱导心脏损伤的机制，研究者对心脏组织进行了 RNA 测序。比较分析显示，CON 组与 Ang II 组之间共有352个差异表达基因，其中133个上调、219个下调；Ang II 组与 Ang II + FAN 组之间共有109个差异表达基因，其中52个上调、57个下调。KEGG 通路富集分析在两组比较中均提示自噬是关键枢纽通路，说明其可能在 FAN 介导的心脏保护中发挥重要作用。样本间相关性分析显示，不同实验组之间分离清晰，组内一致性较高。

线粒体自噬是一种专门靶向受损线粒体的自噬反应，可清除潜在具有细胞毒性的线粒体。由于线粒体在心血管系统能量代谢中处于核心位置，线粒体自噬对于维持心血管稳态和应对疾病状态尤为重要。为证明线粒体自噬激活是 FAN 心脏保护作用的机制基础，研究者检测了线粒体自噬通路中的关键调控因子。Western blot 结果显示，FAN 处理可上调 PGC-1α 及其上游调控因子 AMPK 和 SIRT1 的表达。PCR 分析也证实，FAN 显著上调 PGC-1α 的 mRNA 表达。

此外，RNA 测序还用于预测潜在相关转录因子。结果显示，FAN 可调控25个基因。对这些基因进行转录因子扰动和表达分析后，STAT6 被提示可能参与其中，并位列预测转录因子前3位。进一步验证 STAT6 激活状态显示，Ang II 输注显著增加小鼠心脏组织中 STAT6 Tyr641 位点的磷酸化水平，而 FAN 处理可有效抑制这一激活。核质分离实验进一步显示，Ang II 可促进 STAT6 在细胞核内积累，而 FAN 可逆转这一趋势。总体而言，转录组学分析和分子验证共同表明，FAN 一方面通过激活自噬通路，另一方面通过抑制转录因子 STAT6 的异常激活，从而缓解 Ang II 诱导的心脏损伤。

图5：粉防己碱（FAN）通过激活自噬通路缓解心力衰竭（HF）。（a）对照组与血管紧张素 II（Ang II）处理组之间差异表达基因的柱状图。（b）Ang II 处理组与 FAN 预处理组之间差异表达基因的柱状图。（c，d）Ang II 处理组与对照组之间差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。（c）气泡图，（d）柱状图。（e，f）Ang II 处理组与 FAN 预处理组之间差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。（e）气泡图，（f）柱状图。（g）样本间相关性分析。（h）心脏组织中 AMPK、p-AMPK、SIRT1 和 PGC-1α 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（i–k）使用 ImageJ 软件对 H 图中相应蛋白条带强度进行定量分析。（l）Ang II 处理组相对于对照组、Ang II 处理组相对于 FAN 预处理 + Ang II 处理组的上调基因维恩图。（m）转录因子扰动分析的排名列表。（n）通过免疫印迹检测全心脏裂解液中 p-STAT6（Tyr641）水平。（o）使用 ImageJ 对 N 图中蛋白条带强度进行定量分析。（p）通过免疫印迹分析心脏裂解液核组分和胞质组分中的 STAT6 水平。（q，r）使用 ImageJ 对 P 图中蛋白条带强度进行定量分析。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 恢复自噬通量并抑制铁死亡，从而缓解心力衰竭

为阐明 FAN 改善 Ang II 诱导心力衰竭的机制，研究者首先检测了与线粒体稳态密切相关的 P53 通路。Western blot 显示，Ang II 显著上调 P21 和 P53 表达，而 FAN 处理能够有效逆转这些不利的分子变化。

Ang II 刺激还抑制了 ULK1 的磷酸化及其下游蛋白表达，并伴随 P62 在小鼠心脏组织中积累，提示 Ang II 抑制自噬降解通路。不同浓度 FAN 预处理可呈浓度依赖性逆转这种自噬抑制。与正常组相比，模型组 LC3-II/LC3-I 比值显著降低；而 FAN 处理后该比值明显上调。P62 免疫荧光染色进一步证实，模型组心脏组织中 P62 明显积累，而 FAN 处理可显著降低 P62 积累。这些结果提示，FAN 可有效改善 Ang II 诱导心力衰竭中的自噬受损。

进一步研究显示，Ang II 处理改变了铁死亡相关蛋白的表达。具体而言，心脏组织中 GPX4、CCBR1 和 SLC40A1 表达受到抑制，而 ACSL4 明显上调。生化分析显示，模型组心肌组织中丙二醛（MDA）和 Fe2+ 浓度显著升高，谷胱甘肽（GSH）耗竭；FAN 处理则可显著减轻这些变化。上述结果表明，FAN 可通过抑制铁死亡通路缓解 Ang II 诱导的心力衰竭。

图6：粉防己碱（FAN）通过恢复自噬通量并抑制铁死亡缓解心力衰竭（HF）。（a）心脏组织中 P53、P21 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（b，c）使用 ImageJ 软件对 A 图中相应蛋白条带强度进行定量分析。（d）心脏组织中 ULK1、p-ULK1、P62、mTOR、p-mTOR 和 LC3 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（e–h）使用 ImageJ 软件对 D 图中相应蛋白条带强度进行定量分析。（i）小鼠心脏组织中 P62（绿色）免疫荧光代表性图像，细胞核用 DAPI（蓝色）复染。（j）心脏组织中 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（k–n）使用 ImageJ 软件对 J 图中相应蛋白条带强度进行定量分析。（o）相关标志物丙二醛（MDA）的氧化应激水平。（p）相关标志物 GSH 的氧化应激水平。（q）使用 ELISA 试剂盒测定小鼠血清 Fe2+ 水平。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 在 Ang II 诱导的 NRVMs 中通过激活 PGC-1α 通路改善线粒体功能障碍和自噬受损

为验证 FAN 是否能够减轻 Ang II 诱导的氧化应激，研究者检测了 NRVMs 中 ROS 的生成。代表性图像显示，Ang II 诱导后绿色荧光增强，提示细胞内 ROS 生成显著升高；而 FAN 处理可明显减轻这一氧化爆发。

Western blot 分析显示，Ang II 刺激显著上调 P21 和 P53，同时抑制 AMPK 磷酸化以及 SIRT1 和 PGC-1α 的表达；FAN 预处理可有效逆转这些变化。SIRT1 免疫荧光染色也验证了这一作用。Ang II 处理 NRVMs 后，p-ULK1 及其下游蛋白表达受到抑制，P62 和 p-mTOR 水平升高，提示自噬降解通路受抑。与对照组相比，模型组 LC3-II/LC3-I 比值显著降低，而 FAN 处理后该比值明显升高。

为了判断 FAN 是否以 PGC-1α 依赖方式发挥作用，研究者在 NRVMs 中敲低 PGC-1α。结果显示，Ang II 可增加 P62 水平并降低 LC3-II/LC3-I 比值，而 FAN 能逆转这些变化。然而，PGC-1α 敲低明显削弱 FAN 的保护效应，说明 FAN 通过 PGC-1α 恢复自噬通量。进一步的免疫荧光共定位实验显示，FAN 处理显著增强 LC3 与线粒体蛋白 TOM20 的共定位信号。线粒体膜电位（Δψm）是反映细胞健康状况的重要指标，JC-1 染色显示 Ang II 诱导 Δψm 去极化，表现为绿色荧光增强；而 FAN 共处理可明显减轻这一变化，提示其能够保护线粒体功能。总体而言，这些结果表明，FAN 可通过激活 PGC-1α，减轻 Ang II 诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和自噬通量受损。

图7：粉防己碱（FAN）在 Ang II 诱导的新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中，通过激活 PGC-1α 通路改善线粒体功能障碍和自噬受损。（a）ROS 生成及相应荧光强度的代表性图像。（b）NRVMs 中 P53、P21、AMPK、p-AMPK、PGC-1α 和 SIRT1 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（c–g）使用 ImageJ 对 B 图中蛋白条带强度进行定量分析。（h）NRVMs 中 SIRT1 的免疫荧光染色。免疫反应显示为红色。细胞用 DAPI 复染（蓝色）（比例尺 = 100 μm）。（i）NRVMs 中 ULK1、p-ULK1、P62、mTOR、p-mTOR 和 LC3 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（j–m）使用 ImageJ 对 I 图中蛋白条带强度进行定量分析。（n）代表性免疫荧光图像显示 NRVMs 中 LC3（绿色）与 TOM20（红色）的共定位。细胞核用 DAPI 复染（蓝色）（比例尺 = 100 μm）。（o）JC-1 染色及荧光强度的代表性图像（比例尺 = 100 μm）。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

FAN 可直接结合 PGC-1α 并促进 STAT6-PGC-1α 相互作用

为确定 FAN 的直接分子靶点并阐明其作用机制，研究者开展了系统性的结合和相互作用分析。分子对接结果显示，FAN 可与 AMPK、SIRT1 和 PGC-1α 结合，其中与 PGC-1α 的结合最稳定，结合能为 −7.5 kcal mol−1。药物亲和反应靶点稳定性实验（DARTS）显示，FAN 处理可改变细胞裂解液中 PGC-1α 对蛋白酶的敏感性，提示 FAN 可直接结合 PGC-1α。

细胞热迁移实验（CETSA）是一种可在完整细胞中检测配体或药物结合导致蛋白稳定性变化的生物物理技术。结果显示，FAN 处理细胞中 PGC-1α 显著稳定，提示 FAN 可直接作用于 PGC-1α。表面等离子共振（SPR）实验进一步证实，FAN 能够以较强亲和力直接结合 PGC-1α。研究者还在心肌细胞中进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验，结果证明内源性 STAT6 与 PGC-1α 在基础状态下存在直接物理相互作用，而 FAN 处理可显著促进 STAT6-PGC-1α 相互作用。

图8：粉防己碱（FAN）促进 STAT6-PGC-1α 相互作用。（a）FAN 与 AMPK 的分子对接。（b）FAN 与 SIRT1 的分子对接。（c）FAN 与 PGC-1α 的分子对接。（d）药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验显示，FAN 处理增加细胞裂解液中 PGC-1α 对蛋白酶的敏感性。（e）使用 ImageJ 软件对相应蛋白条带强度进行定量分析。（f）新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）用 6 μM FAN 处理2小时，随后在不同温度下加热3分钟。经冻融循环裂解细胞后，通过 Western blot 检测可溶性 PGC-1α 蛋白水平。（g）FAN 与 PGC-1α 之间的表面等离子共振（SPR）分析。（h）在转染 Flag-PGC-1α 的 NRVMs 中，使用抗 Flag 抗体进行共免疫沉淀（Co-IP）实验，随后通过免疫印迹检测其与 STAT6 的结合。IgG 作为 Co-IP 阴性对照。（i）使用抗 PGC-1α 抗体进行免疫沉淀后，对输入样本和 Co-IP 样本进行免疫印迹，并检测 STAT6。GAPDH 作为输入裂解液的上样内参。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比；ns = 与 CON 组相比无显著性差异。

PGC-1α 通过调节 GPX4/ACSL4 通路影响 Ang II 诱导的心肌细胞凋亡和铁死亡相关损伤

为明确激活 PGC-1α 是否足以模拟并介导 FAN 的完整心脏保护作用，研究者在 NRVMs 中进行了 PGC-1α 过表达实验。与对照组相比，Ang II 处理诱导典型的铁死亡超微结构特征，包括线粒体电子密度明显升高、嵴结构紊乱以及膜完整性丧失。值得注意的是，在 Ang II 刺激前过表达 Flag-PGC-1α 可阻止这些超微结构损伤。更重要的是，FAN 与 PGC-1α 过表达联合处理并未产生进一步的协同保护作用。

Western blot 分析一致显示，PGC-1α 过表达可有效逆转 Ang II 诱导的铁死亡相关蛋白异常，包括 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4。类似地，在 PGC-1α 过表达细胞中加入 FAN 后，并未进一步显著调节这些蛋白水平。GPX4 免疫荧光染色进一步证实，在 Ang II 刺激下，PGC-1α 过表达可完全维持心肌细胞中 GPX4 的高表达水平，联合处理没有额外优势。流式细胞术分析凋亡也与上述结果一致：Ang II 诱导显著凋亡，而 PGC-1α 过表达完全阻断了这一过程，二者联合并未提供额外保护。

总体而言，这些结果表明，PGC-1α 的激活不仅是 FAN 发挥核心保护作用所必需的，而且足以完整复现 FAN 的主要保护效应。当 PGC-1α 已被充分激活时，额外给予 FAN 不再产生显著增量保护作用。这进一步确认 PGC-1α 是 FAN 抑制铁死亡并保护心肌细胞的核心下游枢纽，其作用主要通过 PGC-1α 激活及其对 GPX4/ACSL4 通路的调控实现。

图9：PGC-1α 通过调节 GPX4/ACSL4 通路影响 Ang II 诱导的心肌细胞凋亡。（a）使用 Flag-PGC-1α 在新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中过表达 PGC-1α。对照转染采用空载体（EV）质粒。PGC-1α 过表达后，细胞在暴露于 Ang II（1 μM）2小时之前，先用或不用 10 μM FAN 预处理1小时。图中显示代表性透射电子显微镜（TEM）图像。（b）NRVMs 中 GPX4、CCBR1、SLC40A1 和 ACSL4 的代表性 Western blot 分析结果。GAPDH 作为上样内参。（c–f）使用 ImageJ 对 B 图中蛋白条带强度进行定量分析。（g）NRVMs 中 GPX4 的免疫荧光染色。免疫反应显示为绿色。细胞用 DAPI 复染（蓝色）（比例尺 = 100 μm）。（h）代表性流式细胞术图像。所有定量数据均以 mean ± SEM 表示；n = 6；*P < 0.05，与 CON 组相比； < 0.05，与 Ang II 组相比。

STAT6 作为转录因子促进 PPARγ 表达

已有研究提示，STAT6 转录因子可在巨噬细胞中促进 PPARγ 通路激活。为进一步考察 STAT6 调控的下游基因，研究者发现 STAT6 可促进 PPARγ 基因表达，而 FAN 可通过抑制 STAT6 下调 PPARγ 表达。利用 JASPAR 数据库预测发现，PPARγ 启动子区域存在 STAT6 结合位点。

双荧光素酶报告实验显示，STAT6 可增强 PPARγ 的荧光素酶活性，而 FAN 可通过抑制 STAT6 表达降低这种活性。为确定 STAT6 在 PPARγ 启动子中的具体结合位点，研究者构建了不同截短长度的 PPARγ 启动子质粒。结果显示，STAT6 对 PPARγ 启动子活性的调控取决于其与 −1008 至 −999 bp 区域位点的结合。进一步突变该区域结合位点后，STAT6 对 PPARγ 启动子荧光素酶活性的影响被消除。ChIP 实验进一步证实，STAT6 能够结合 PPARγ 启动子 −1008 至 −999 bp 区域。综上，PPARγ 是 STAT6 的下游调控基因。

图10：转录因子 STAT6 促进 PPARγ 表达。（a）实时 qPCR 分析显示 PPARγ 的 mRNA 水平。（b）利用在线转录因子预测软件 JASPAR 获得 STAT6 与 PPARγ 启动子区域之间的潜在结合序列。（c）在新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中，共转染含有 PPARγ 启动子序列的荧光素酶报告质粒和 STAT6 过表达质粒，并在有或无 10 μM FAN 条件下检测相对荧光素酶活性。（d）在 NRVMs 细胞中，共转染含有不同截短 PPARγ 启动子序列的荧光素酶报告质粒和 STAT6 过表达质粒，并检测相对荧光素酶活性。（e）PPARγ 在 −1008 至 −999 区域的突变序列及其荧光素酶活性。（f）通过 ChIP-qPCR 分析 STAT6 与 PPARγ 启动子的结合。IgG 作为阴性对照。*P < 0.05， < 0.05，双尾 Student's t 检验。

【贡献】★★★★★

总之，粉防己碱（FAN）通过调控 PGC-1α/STAT6/PPARγ 信号轴，对 Ang II 诱导的心脏损伤发挥保护作用，从而将线粒体适应能力与铁死亡性细胞死亡的调控联系起来。这一整合机制进一步完善了当前对心力衰竭的理解，即在持续应激条件下，心肌细胞生存受到一个协调的“线粒体—转录调控网络”支配。该研究的重要启示在于，选择性调节这一信号轴，可能比广泛抑制上游神经体液信号更有利于精准控制细胞命运。未来研究需要进一步阐明该通路在人类心肌中的层级结构和时间性激活规律，并验证调控该通路是否能在不同心力衰竭亚型中带来一致获益。总体来看，靶向汇聚性调控节点，而不是孤立通路，可能是推进心力衰竭治疗策略发展的更有效方向。

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