浙江
人们对DNA甲基化如何影响转录因子结合的认识大多来自哺乳动物和少数植物转录因子的研究。番茄成熟过程中全基因组范围内会发生大规模的DNA去甲基化事件，由去甲基化酶SIDML2介导。2026年7月1日，南方科技大学郎曌博教授和杜嘉木教授团队在《自然·通讯》发表论文，报道了番茄果实成熟过程中DNA去甲基化通过帮助转录抑制因子结合靶基因启动子来调控酯类香气物质合成的机制。
研究团队采用DAP-seq技术结合全基因组甲基化测序来评估DNA甲基化对SISPL-CNR结合的影响。DAP-seq能够保留基因组DNA上原有的5-甲基胞嘧啶修饰。他们同时做了经过PCR扩增的ampDAP-seq作为对照，因为扩增过程会消除几乎所有的甲基化修饰。通过比较两组数据，他们发现大量甲基化程度高的区域在去甲基化后获得了SISPL-CNR的结合。进一步分析显示结合基序GTACGG中第四个位置的胞嘧啶甲基化对结合的抑制作用最为明显，相关系数达到了-0.59。电泳迁移率实验和等温滴定量热实验也显示甲基化会将结合亲和力降低几十倍。
进一步地晶体结构解析显示，SISPL-CNR的SBP结构域与包含GTACGG序列的DNA形成了1.7埃分辨率的复合物结构。结构显示蛋白通过多个氢键和盐桥与DNA骨架相互作用，Gln94和Gln95两个残基对碱基的识别至关重要。当把基序中第七位的胞嘧啶模拟为甲基化状态时，甲基基团会与Gln94的主链羰基产生严重空间冲突。由于DNA和蛋白都无法通过构象调整来规避这种冲突，甲基化DNA就无法被SISPL-CNR有效识别。他们还测试了来自水稻、玉米和番茄的多个SPL家族蛋白的SBP结构域，包括水稻中调控株型的OsSPL14和玉米中调控株型的ZmSPL15，所有测试的蛋白都表现出相同的甲基化敏感特征。
研究团队进一步比较了体外DAP-seq数据和体内ChIP-seq数据。体内实验使用表达SISPL-CNR-3xFLAG融合蛋白的转基因番茄果实。他们发现约90%的体内结合位点都能被体外DAP-seq捕获，而那些只在体外检测到的结合位点大多位于基因组上染色质开放性较低的区域，缺乏DHS信号和H3K4me3、H3K27ac等活性组蛋白修饰标记。作者将DAP-seq数据限制在DHS区域内之后，预测体内结合位点的准确率明显提高。
SIAAT1编码醇酰基转移酶，是番茄果实中酯类香气物质合成的关键酶。随着果实从绿熟期向破色期转变，SIAAT1启动子区域的甲基化水平显著下降，尤其是在GTACGG基序第四个胞嘧啶的位置上。双荧光素酶报告实验显示SISPL-CNR对SIAAT1启动子驱动的表达有抑制作用。CRISPR/Cas9敲除SISPL-CNR后，SIAAT1的转录水平在破色期果实中明显高于野生型。代谢组分析显示敲除株系中多种酯类香气物质的含量显著增加。去甲基化酶SIDML2能够直接结合SIAAT1启动子并在成熟过程中介导其去甲基化，但在SISPL-CNR敲除株系中启动子甲基化水平没有发生变化。
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