【PNAS】貌合神离！MIT冯国平团队通过多模态分析方法揭示未定带的细胞多样性及分化回路

撰文：大仲马

在大脑深处，丘脑腹侧藏着一个不起眼却“管得特宽”的神秘地带——未定带。在脑科学版图里，它像个身份扑朔迷离的幕后工作者。抬手迈步、屏蔽杂音、感知疼痛，甚至面临危险时心跳加速的本能防卫，背后都有它的影子。它还是个“性情中人”，紧密参与着我们的进食欲望和那份按捺不住的新鲜感与探索欲。

图片来源： Nature(2016)

近年来，科学家发现它手握如此多的权力后，临床医学也投来热切目光。医生们设想，若能更懂这个区域，或许能找到更精妙的按钮，通过深部脑刺激或其他疗法，缓解帕金森病等运动障碍，甚至抚平精神疾病患者的痛苦。早在这股热潮之前，大家就隐约察觉，未定带内部住着形态功能各异的细胞，且人脉极广，神经联络遍布大脑各层级。然而麻烦也正源于此：知识碎片散落一地，我们始终缺少一份详尽的“居民户口本”——一套权威的细胞分类学。

图片来源： Science (2022)

于是，许多看似基础却悬而未决的空白留了下来。边界从哪儿起到哪儿止，模糊不清；里面到底住了哪些细胞，也没能说清。已有研究按粗略的解剖分区去测绘内部神经元的连接网络，但一个根本疑问始终挥之不去：这张网，在不同“性格”的神经元小群体之间，会不会长得完全不一样？翻阅文献更像听一场激烈辩论——关于它到底使用哪几种神经递质这种最根本的“语言问题”，连各类细胞的数量占比都众说纷纭。就连想为它的运作搭建最简单的模型，都面临地基不稳的难题。

图片来源： Neuroscience (2005)

近日，《PNAS》杂志在线刊登了MIT冯国平课题组的最新重要工作，改研究联合运用单核RNA测序与荧光原位杂交技术，建立了能够区分未定带及其周围结构的遗传标志物，并据此界定了未定带内部的亚区。

在此基础上，作者依据神经元独特的分子表型、内在电生理特性及轴突投射模式，将其划分为四个不同的群体。他们描绘了这四类未定带神经元在未定带内部的空间分布特征，并构建了一种Cre驱动工具鼠系，从而为未定带吻侧富集的一个神经元亚型提供了遗传学通路。

通过单突触示踪实验，他们揭示了这四类未定带神经元各自的输入来源，进而将其分别定位于各自的全脑网络之中。最后，作者采用一种整合了先前报道依赖未定带的多个脑功能域的行为范式，探究了特定投射定义下的未定带神经元亚群的功能特性。

综上，该研究成果为理解未定带的细胞多样性、阐明特定未定带神经元亚型在全脑环路中的嵌入方式、揭示其参与多种生理与行为过程的机制，以及探索其是否可作为病理状态治疗的选择性靶点，奠定了基础。

未定带神经元的转录组学与解剖学特征

为探究未定带神经元的多样性，作者从成年野生型小鼠脑切片中显微分离未定带，经荧光激活细胞核分选纯化后进行单细胞核RNA测序。其中，GABA能神经元占75.5%，谷氨酸能神经元占20.0%，另有少量胶质细胞。经与公开全脑单细胞测序数据整合比对，大部分细胞被标注为ZI Pax6 GABA能亚类，而谷氨酸能神经元则被归为邻近脑区（如背侧丘脑、底丘脑核）的亚类，可能存在共分离污染。

然后，作者采用荧光原位杂交绘制了Gad2、Slc17a6和Pax6的表达图谱（图1A及补充附录，图S3 A和B）。这些基因的表达模式清晰界定了未定带的边界：尾侧、外侧和腹侧边界以Gad2与Pax6共表达为特征（补充附录，图S3A），背侧则以Slc17a6阳性的丘脑与Gad2阳性未定带分界。前外侧与丘脑网状核交界处，未定带以Gad2/Pax6共表达区别于后者的Pvalb/Gad2共表达（补充附录，图S4）。边界内Gad2阳性细胞占绝对主导（87.9%，图1 B和C），Vglut2阳性细胞仅占12.1%且多集中于尾极（补充附录，图S3），与Gad2/Pax6共表达细胞交错分布。空间转录组分析进一步表明，这些谷氨酸能神经元并非未定带特有，而是来自邻近脑区的溢入（补充附录，图S3 C）。

剔除污染细胞簇后重新聚类（图1D），保留的神经元全部为GABA能（图1E）。他们引入Vgat-Cre小鼠系向未定带注射Cre依赖病毒以示踪传出投射（补充附录，图S5），此实验可标记出广泛的下行抑制性投射，其主要下游为同侧上丘、导水管周围灰质、脑桥网状核等脑干结构，亦投射至部分丘脑和下丘脑区域。

笔者注：在单细胞测序实验中，共分离污染指的是，当研究者试图从脑组织中精确切取某个目标核团时，由于该核团边界不规则、与周围组织交错镶嵌，或显微分离精度有限，不可避免地连带切下了少量紧邻的非目标区域组织。这些"误入"的细胞随后与目标细胞一同经历细胞核分离、分选和测序，最终在数据集中表现为本不属于该核团的细胞类型，从而对细胞分类和比例估算造成干扰。

图1 未定带神经元的转录组学与解剖学特征

未定带背侧与腹侧GABA能神经元的转录组学及解剖学差异

然后，作者将未定带神经元RNA在四个分辨率水平上重新聚类（补充附录，图S6），并确认聚类合理性，发现最高分辨率下22个聚类中仅有两个彼此无显著差异。经与艾伦研究所ABC图谱层级比对，作者的四个聚类水平大致对应于超型和聚类分辨率水平，最精细水平上二者调整互信息为0.51，且ABC超型标签与他们的第三、四级聚类具有一致对应关系（补充附录，图S7）。

差异表达基因分析揭示了显著的转录组多样性（图2A）。Pax6、Meis2、Kcng2和Ptprk在所有聚类分辨率上均呈互补表达（图2 A–C）。荧光原位杂交证实这些转录组标记了空间分离的Gad2阳性神经元群体（图2D及补充附录，图S8）：Pax6定位于腹侧和尾侧亚区，Kcng2和Ptprk定位于背侧亚区，Meis2则与Pax6共表达于腹侧（补充附录，图S9）。Kcng2阳性背侧亚型在后部更为丰富（补充附录，图S8A）。定量统计显示Pax6阳性细胞约为Kcng2阳性细胞的两倍（图2 E和F）。

作者结合逆行示踪与荧光原位杂交手段，发现未定带传出投射因靶区而异：红核、脑桥网状核等被盖脑干区域主要接受背侧Kcng2阳性神经元输入，而丘脑后内侧核、上丘和背内侧导水管周围灰质等高级脑区则更多接受腹侧Pax6阳性神经元输入（补充附录，图S10及S11）。CTB双标逆行示踪进一步表明，未定带-上丘投射神经元与未定带-脑桥网状核投射神经元分别分布于腹侧和背侧，双标比例不足5%（补充附录，图S12）。狂犬病病毒介导的顺行示踪亦证实二者几乎不共标。因此，未定带-上丘通路与未定带-脑桥网状核通路由相互分离的神经元群体构成。

笔者注：上丘与脑桥网状核分别代表了未定带下行投射所调控的两大功能域：上丘作为中脑顶盖的多层感觉运动整合中枢，主要负责多感官信息整合与定向行为（包括眼动、头转、防御性躲避），在研究中被视为接受腹侧未定带Pax6阳性神经元输入的“高级脑区”通路；而脑桥网状核作为脑桥被盖网状结构的一部分，主要参与躯干四肢的运动执行、姿势维持和惊跳反应，接受背侧未定带Kcng2阳性神经元输入，构成偏向运动控制的通路。

二者分别对应“感知-定向”与“运动-执行”两大功能模块，而文中通过逆行示踪和侧枝分析证实这两条通路几乎完全由相互分离的未定带神经元群体构成，从环路层面为未定带背侧与腹侧神经元的功能分工提供了清晰的结构基础。

图2 未定带背侧与腹侧GABA能神经元的转录组学及解剖学差异

腹侧未定带内存在两种不同GABA能神经元亚型

鉴于Pax6阳性未定带神经元包含多个测序聚类（图2A）且腹侧未定带向多个脑区投射，作者计划寻找Pax6阳性神经元亚群的特异性标志物。在较高聚类分辨率下，Slc30a3和Spp1呈反相关分布（图3 A–C）。荧光原位杂交共标结果显示，Pax6/Slc30a3阳性与Pax6/Spp1阳性神经元是重叠极少且解剖上相互分离的腹侧未定带亚群（图3C及补充附录，图S13）：前者占据未定带前内侧，后者富集于后外侧，前者的数量约为后者的三倍（图3D）。另有一小群三阳性神经元位于两群交界面（补充附录，图S13 D–F）。

作者构建了Slc30a3-Cre小鼠并引入已有的Spp1-Cre小鼠，通过全细胞膜片钳记录表征了两群神经元的电生理特性（补充附录，图S14 A和B）。Slc30a3神经元胞体较小、膜电容较低，但膜电阻较高（图3 E和F）。二者动作电位波形存在多方面差异：Slc30a3神经元动作电位幅值更大、动力学更慢（补充附录，图S14 C–H）。Spp1神经元在递增电流注入下表现出更大的动作电位输出动态范围，且锋电位频率适应极小，而Slc30a3神经元在中大电流下常出现去极化阻滞（图3G及补充附录，图S14I），这与Spp1神经元共表达Pvalb的特征一致（图3A）。

顺行示踪结果显示，两群神经元投射模式亦有不同（补充附录，图S15 A和B）：Slc30a3神经元特异性支配导水管周围灰质的背内侧和腹外侧亚区，而两类神经元均投射至上丘，并在高级丘脑区域汇聚。逆行示踪结合荧光原位杂交验证了上述结果，其中，投射至背内侧导水管周围灰质的神经元以Slc30a3表达为主，主要分布于未定带前半部（补充附录，图S15 C和D及图S10B）。

笔者注：Slc30a3和Spp1是区分腹侧未定带Pax6阳性GABA能神经元两个亚群的核心标志基因。Slc30a3编码负责囊泡锌离子转运的锌转运蛋白3，其阳性神经元分布于未定带前内侧，胞体较小、膜电阻较高、动作电位幅值大但动力学较慢，在中大电流下易出现去极化阻滞，并特异性投射至导水管周围灰质；而Spp1编码参与细胞黏附与免疫调节的分泌性磷蛋白骨桥蛋白，其阳性神经元分布于未定带后外侧，胞体较大、共表达Pvalb，表现为快速放电且几乎无锋电位频率适应，与Slc30a3神经元共同投射至上丘和高级丘脑区域。

两者在空间分布、电生理特性和投射模式上的系统差异，为腹侧未定带内部的功能异质性提供了清晰的分子与环路基础。

那么，背侧未定带有不同神经亚群吗？

图3 腹侧未定带内存在两种不同GABA能神经元亚型

背侧未定带内存在两种不同GABA能神经元亚型

背侧未定带是否同质尚不明确。既往研究认为，背侧未定带主要由谷氨酸能神经元构成，但上文测序与荧光原位杂交数据表明未定带内谷氨酸能神经元极少（图1及补充附录，图S2）。Kcng2与Ptprk在GABA能亚聚类中的共表达及在背侧未定带中的定位（图2 A、C和D及补充附录，图S8C），证实这些亚聚类可代表背侧未定带。

在第四级聚类下，作者观察到多个假定的背侧ZI亚聚类（图4A），并发现传统背侧标志物Nos1仅标记其中一部分Kcng2/Ptprk共表达聚类，而另一亚聚类则以Cyp39a1和Spp1为特征（图4A）。荧光原位杂交共染色证实Nos1与Spp1标记背侧未定带中几乎不重叠的Kcng2阳性群体（图4 B和C及补充附录，图S16D），且前者数量约为后者的四倍（图4D）。

全细胞膜片钳记录显示（补充附录，图S17 A和B），Spp1背侧神经元较Nos1神经元具有更高的膜电容和更低的膜电阻（图4 E和F），动作电位幅值略大且动力学更快（补充附录，图S17 E–G），而Nos1神经元在中大电流注入下常出现去极化诱发动作电位阻滞（图4G及补充附录，图S17I）。顺行示踪表明两群神经元均向中脑和脑桥脑干区域发出投射（补充附录，图S18 A和B），荧光原位杂交进一步证实Spp1阳性和Nos1阳性背侧未定带神经元均投射至脑桥（补充附录，图S18 C和D）。

图4 背侧未定带内存在两种不同GABA能神经元亚型

未定带-脑桥与未定带-上丘亚网络的功能差异

为探究未定带亚网络的功能，作者建立了一种行为范式：食物剥夺小鼠在设有庇护所的狭长旷场中觅食牛奶，同时在摄取奖赏期间面临先天性威胁性视觉刺激（逼近刺激）（图5A及6A）。经过3天训练，小鼠学会了从随机指定的活跃端口获取牛奶，成功率逐日提高、反应时间逐渐缩短（图5 B和C），且奖赏体积与舔舐回合持续时间呈正相关（图5 D和E）。

作者通过向上丘或脑桥网状核注射RV∆L-5Cre、向同侧未定带注射AAV-synFLEX-jGCaMP8m并植入光纤，记录了投射至上丘和脑桥网状核的未定带神经元钙活动（图5F）。两条通路均受舔舐行为影响，但模式不同：未定带-上丘群体在舔舐开始前出现短暂活动增加（图5 G和M左图，图5J），而未定带-脑桥网状核群体在舔舐前几乎无调制，舔舐开始后则受到更强抑制（图5 G和M右图），且抑制幅度与舔舐回合持续时间相关，舔舐终止时活动急剧恢复至基线（图5 H和N右图，图5 K和L）。长舔舐回合中未定带-上丘通路也受到抑制，可能反映运动静止相关的调制。

第四天，小鼠在基线觅食试验后，于远端端口摄取牛奶时遭遇舔舐触发的逼近刺激（图6 A和D），制造了继续舔舐与逃离威胁的冲突（图6B）。逼近刺激通常终止舔舐并引发朝向庇护所的逃跑（图6 B–D及补充附录，图S22A）。当逃跑被抑制、小鼠继续舔舐时，两条通路的活动模式与无干扰舔舐时一致：未定带-上丘在舔舐开始前活动增加、舔舐期间调制极小（图6F），而未定带-脑桥网状核全程受抑制（图6G）。在触发逃跑的试验中，两条通路的活动在逃跑起始后均大幅增加且幅度相似（图6 H–K）。逃跑后常伴随庇护所内的僵直行为，此时两群体活动均受抑制（图6 L和M），且未定带-上丘的抑制幅度显著大于未定带-脑桥网状核（图6 N和O）。

图5 未定带-脑桥与未定带-上丘神经元群体在奖赏摄取过程中的差异性活动动态

图6 未定带-脑桥与未定带-上丘神经元群体在威胁-奖赏冲突中的活动动态

本文的局限性

本篇文章十分精彩，但并非完美无瑕：

1、环路连接方面，作者通过单突触示踪绘制了不同未定带神经元亚型的全脑输入图谱，并揭示了如ZI-SC Slc30a3+亚型在输入来源上的独特性，但特定脑区对特定未定带亚型的突触输入是否具有因果性调控作用，尚未通过光遗传学或化学遗传学等功能性实验加以验证。因此，这些解剖上的输入连接究竟在多大程度上转化为具有行为意义的功能性调控，仍有待进一步探究。

2、有关未定带下游的功能系统，本文未做全面解读。其一，未定带此前被报道参与运动控制、感觉门控、新奇探索等多种行为域，但本研究的行为范式仅聚焦于奖赏摄取与威胁应对，未定带各亚型在其他行为功能中的角色有待进一步探究；其二，不同未定带亚型向各自下游靶区传递的信号性质及其在突触后水平的功能效应，仍缺乏电生理或功能成像层面的直接证据，这限制了从环路结构到行为功能的完整因果链构建。

3、文章用到的行为范式均为急性趋避冲突及其伴随的防御行为，所检测的功能维度相对有限。那么，未定带亚网络是否参与慢性应激、焦虑或成瘾等涉及类似环路但病程更为持久的行为过程呢？这些具有更高临床转化价值的慢性行为范式，可能是未来研究的重要方向。

总结

未定带在多种行为功能中发挥重要作用，且正逐渐成为深部脑刺激治疗神经系统疾病的新兴临床靶点。尽管其重要性不言而喻，但未定带的细胞类型组成以及连接特定未定带细胞类型与全脑环路的解剖环路组织仍不清楚。

本研究采用单细胞核RNA测序、空间RNA分析、离体电生理学及解剖环路示踪，构建了未定带的多模态细胞图谱，并解析了特定未定带细胞类型的全脑单突触输入。作者界定了四个遗传学上不同的未定带GABA能神经元群体，这些群体表现出独特的空间分布、特化的内在电生理特性、分化的传出投射以及细胞类型依赖的突触输入模式。最后，利用光纤光度记录技术，作者在一个围绕由奖赏性刺激与先天性厌恶刺激所产生的趋避冲突的行为范式中，揭示了不同未定带细胞类型之间的反应差异。

因此，本研究为未来旨在理解未定带组织与功能的实验设计与解读提供了理论基础，意义重大。

参考文献

Kast R, Simmons SK, Rome N, Adiconis X, Melamed L, McCabe KA, Wang D, Krol A, Krubner M, Prevosto V, Levandowski K, Sabbagh U, Sullivan HA, Wickersham IR, Wang F, Levin JZ, Fu Z, Feng G. Multimodal analysis reveals cellular diversity and divergent circuits of the zona incerta. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026 May 5;123(18):e2509781123. doi: 10.1073/pnas.2509781123. Epub 2026 Apr 29. PMID: 42054363; PMCID: PMC13143026.

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