《CEJ》水凝胶高效分离和持续释放外泌体

背景介绍

伤口愈合不充分会引发增生性瘢痕等并发症，严重影响患者身心健康，因此亟需有效的治疗手段。外泌体作为富含核酸、蛋白和脂质等活性成分的细胞外囊泡，在促进血管再生和组织修复方面显示出独特优势，但其实际应用受限于分离方法（如超速离心、PEG沉淀等）效率低、成本高、不适合工业放大，以及长期储存（如-80°C冷冻）易破坏其脂质膜结构、导致活性丧失等问题。与此同时，水凝胶作为活性分子的递送载体虽具潜力，但现有天然多糖-金属离子体系（如海藻酸钠-钙）因“蛋盒”状结构保水率过高而不适于外泌体捕获，而普鲁兰多糖虽力学性能优异，却结构稳定性不足。因此，亟需开发一种能同时实现外泌体高效分离、稳定储存和可控释放的新型水凝胶材料体系，以推动其临床应用和产业化发展。

研究思路

为克服外泌体疗法在伤口愈合中面临的分离流程复杂、成本高以及储存稳定性差等瓶颈，研究者设计了一种由普鲁兰多糖/钙离子构成内层核心、海藻酸钠形成外层分离凝胶的双层多糖水凝胶。该体系结合冻干与超声辅助溶解技术，能够高效富集外泌体（分离得率达87.2%，与超速离心相当），同时保持其形态和蛋白标志物完整性，并实现至少7天的持续可控释放。体内实验表明，该水凝胶可促进成纤维细胞增殖长达一周，使小鼠伤口模型的ROS含量降低92%，并将COL-I/COL-III比率调节至0.58，转录组分析也证实了相关通路的显著改变。总体而言，该双层水凝胶为外泌体的分离与控释递送提供了一个集成平台，为后续转化研究奠定了实验基础。

研究结果

1. PL + Ca + SA 水凝胶的表征

对PL+Ca+SA水凝胶的全面表征表明，该材料形成了协同稳定的双网络结构。宏观上，PL+Ca+SA和SA+Ca均呈现白色块状水凝胶，但PL的引入使结构密度略有降低；紫外光谱和FTIR分析证实，钙离子分别与SA和PL形成离子键，且PL链与SA-Ca网络间还存在强氢键相互作用，从而构建了紧密互穿的双网络体系。流变学分析显示，PL+Ca+SA的储能模量显著高于损耗模量，表现出类固态弹性行为，稳定性优于PL+SA和PL+Ca等单一或二元组合。冻干形态观察表明，PL+Ca+SA有效避免了SA组因机械支撑过强而易碎裂的问题，结构完整性良好。综上，该水凝胶具备优异的交联稳定性和结构完整性，适合用于外泌体的分离、稳定化与释放应用。

图1 .制备的与外泌体( EXO )结合的水凝胶的制备过程和分子结构示意图。A.含外泌体液体的预处理。B.含外泌体水凝胶的制备过程和递送机制示意图。

图2.水凝胶的制备与结构变化。A.PL-Ca-SA复合水凝胶制备过程实物照片。B.紫外光谱法对水凝胶进行表征。C.傅里叶变换红外光谱（FTIR）。D.显微镜下拍摄的形貌照片。E.流变频率扫描曲线。F.黏度曲线。G.水凝胶扫描电镜（SEM）图。

2. 超声处理对水凝胶结构的影响

基于水凝胶的外泌体分离技术核心优势在于高效除水并保护外泌体结构完整性，但SA+Ca水凝胶因交联致密导致脱水困难，需添加PL改善水分去除。冻干后的EXO@PL+Ca+SA水凝胶在室温下可显著延长外泌体储存稳定性（35天保留率>90%，90天保留率50%）。为促进外泌体释放，采用超声辅助溶解破坏SA-Ca离子键，其中400 W/L的适度超声可选择性断裂交联而不致结构完全崩塌，而600 W/L则导致外泌体膜破裂和蛋白泄漏。超声处理后体系从固态转为高粘液态，紫外光谱证实SA-Ca交联减少，表明该技术通过破坏水凝胶分子结构有效促进外泌体可控释放。

图2.超声辅助溶解水凝胶达到了控制释放的效果。A.冻干保存和超声处理对水凝胶结构的示意图。B.冻干水凝胶水分损失的统计分析。C.外泌体在不同储存时间的储存产率。D.不同超声功率处理水凝胶的zeta电位。超声处理对PL+Ca+SA水凝胶冻干粉复溶后流变频率-扫描曲线(F)和黏度(G)特性的影响。E.超声处理后PL+Ca+SA水凝胶的紫外光谱。H.不同超声处理后EXO@PL+Ca+SA水凝胶的蛋白浓度。

3.EXO@PL+Ca+SA水凝胶的表征、分离及释放速率研究

基于PL+Ca+SA的水凝胶外泌体分离方法通过透射电镜观察到清晰囊泡结构，并成功检出ALIX、CD63、TSG101、CD9等标志蛋白，其中ALIX和TSG101因水凝胶对大分子蛋白的阻碍在凝胶组中表达较低。粒径分析显示凝胶组颗粒偏大，可能源于SA碎片及超声导致的PL-外泌体复合物形成。紫外光谱证实外泌体被封装于水凝胶内部而非表面吸附，且分离效率与超速离心法相当，蛋白质浓度略高但杂质水平极低，体现了良好的工业化前景。复溶后水凝胶的剪切模量和粘度不受外泌体影响，释放实验显示封装外泌体呈现一周内完全释放的缓释行为，伴随水凝胶逐渐降解至第八天仅剩约11.6%质量。释放动力学拟合表明，游离外泌体符合一级扩散，而凝胶封装组遵循Higuchi扩散模型，以Fickian扩散为主导，总体说明该水凝胶策略显著提升了外泌体的分离、稳定性和可控释放性能。

图4.EXO@PL+Ca+SA水凝胶的分离效应和释放速率。外泌体TEM表征(A)，Westernblot表征(B)，Westernblot统计分析(C)。EXO和EXO@PL+Ca+SA的总颗粒数(D)，分离率(E)。F.EXO@PL+Ca+SA水凝胶的外泌体释放率。G.EXO@PL+Ca+SA水凝胶的降解速率。EXO@PL+Ca+SA的流变频率-扫速曲线(H)和黏度曲线(I)。J.EXO@PL+Ca+SA水凝胶负载外泌体的紫外光谱研究。水凝胶的零级(K)、一级(L)和Higuchi(M)释放动力学拟合曲线。

4.EXO@PL+Ca+SA对小鼠成纤维细胞增殖、迁移和性能的影响

人脐带间充质干细胞来源的外泌体具有免疫调节和促组织再生能力，将其负载于PL+Ca+SA水凝胶后与小鼠成纤维细胞共培养，结果显示该材料无细胞毒性，细胞生长状态良好，且细胞活力与纯外泌体组无显著差异。增殖实验表明，水凝胶组和纯外泌体组均显著促进成纤维细胞增殖，两者效果相当；线粒体功能检测显示水凝胶组能调节线粒体呼吸链、减少活性氧产生，保障ATP供应从而支持胶原合成。F-actin染色显示水凝胶组在第7天仍保持显著高于对照组的荧光强度，体现其缓释外泌体带来的长期促进效应，划痕实验也证实水凝胶组的持续释放使细胞迁移速度更快、24小时内划痕闭合率高于纯外泌体组。综上，EXO@PL+Ca+SA水凝胶无细胞毒性，并能显著增强成纤维细胞的增殖、迁移及整体生物学功能。

图5.EXO@PL+Ca+SA水凝胶对小鼠成纤维细胞增殖、迁移和生物性能的影响。A.成纤维细胞的生长形态。B.EXO@PL+Ca+SA水凝胶对成纤维细胞的活细胞染色。C.不同处理对成纤维细胞增殖(EdU)的影响。D.EdU增殖率的统计分析。E.EXO@PL+Ca+SA处理的成纤维细胞ROS的形成。F.ROS产生量的统计分析。G.EXO@PL+Ca+SA处理的成纤维细胞在第3天和第7天F-actin的形成。H.F-actin生成的统计分析。

5.EXO@PL+Ca+SA水凝胶有效地促进了小鼠伤口的快速愈合

EXO@PL+Ca+SA水凝胶在小鼠急性伤口模型中显著促进愈合，14天时疤痕极少，组织学显示其再生皮肤富含毛囊和皮脂腺等附属器，结构接近正常皮肤，且肌纤维含量仅30.8%，优于对照组。免疫荧光分析表明，该水凝胶通过缓释外泌体降低ROS水平、上调表皮祖细胞标志CK19、显著抑制疤痕相关COL-I合成并促进COL-III生成，使COL-I/COL-III比值从对照组的13.89降至0.62，同时降低α-SMA阳性肌成纤维细胞数量，从而减轻纤维化。转录组分析进一步证实，水凝胶处理使成纤维细胞中182个基因差异表达，激活IL-17、Wnt及ECM重塑相关通路，促进炎症反应更早启动并调控下游修复过程。综上，EXO@PL+Ca+SA水凝胶通过缓释外泌体调节胶原比例、抑制肌成纤维细胞活化并加速炎症启动，有效促进急性伤口高质量愈合并减少疤痕形成。

图6.EXO@PL+Ca+SA水凝胶有效促进小鼠A伤口快速愈合。EXO@PL+Ca+SA水凝胶处理小鼠伤口模型示意图及伤口愈合过程。B.小鼠伤口愈合的照片记录。C.小鼠(与对照相比)创面恢复过程中创面愈合面积统计。D.小鼠创面组织H&E染色。E.14天创面组织毛囊生长面积。F.小鼠创面组织Masson染色。G.14天时创面组织胶原蛋白表达。

图7.EXO@PL+Ca+SA对小鼠伤口愈合中ROS和胶原类型染色(COL-I/COL-III)的影响。A.小鼠创面组织ROS染色。B.小鼠创面组织CK14和CK19的免疫荧光染色。C.小鼠创面组织COL-I和COL-III的免疫荧光染色。D.小鼠创面组织α-SMA免疫荧光染色。ROS、CK14、CK19、COL-I、COL-III、COL-I/COL-III倍数变化及α-SMA表达的统计分析。

图8.EXO@PL+Ca+SA处理对成纤维细胞影响的转录组分析结果。A.主成分分析(PCA)图显示EXO和EXO@PL+Ca+SA数据集的方差和标准偏差。B.样本间距离分析热图。C.火山图显示差异基因表达谱。D.差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。E.EXO组和EXO@PL+Ca+SA组之间差异表达基因的热图。F.差异表达基因的GO富集分析。G.差异表达基因的Reactome富集分析。H.差异表达基因的KEGG通路富集分析。Il-17(I)、WNT(J)和Ecm-Receptor(K)。

总结与讨论

本研究制备了一种多功能的普鲁兰/海藻酸钠水凝胶，用于外泌体的分离、稳定和有效递送。此外，还检测了凝胶包被外泌体对小鼠模型伤口愈合的影响。PL+Ca+SA水凝胶有效保留了细胞培养基中的外泌体，分离后的外泌体颗粒数与超速离心法无明显差异。此外，双层网格中空结构可以保护外泌体在冷冻干燥过程中免受质量损失。当外泌体水凝胶溶液复溶后，在小鼠体内表现出促进愈合的积极作用。总体而言，本研究通过使用PL+Ca+SA水凝胶有效地整合了外泌体的分离、储存和应用过程。这种创新的方法显著降低了外泌体质量和活性在各个阶段的降解，从而提高了外泌体的运行效率。总之，本研究为工业分离功能性外泌体产品提供了重要的参考。

参考文献：DOI：10.1016/j.cej.2026.174990