Nature Biotechnology | 厦门大学杨朝勇/宋彦龄团队创建Spatial-EV-seq技术实现囊泡空间解析

细胞外囊泡在介导细胞间通讯和调控肿瘤微环境方面发挥着重要作用，但传统分析方法需要将组织解离后再进行超速离心，囊泡的原始空间位置信息在这个过程中几乎丢失殆尽。2026年6月26日，厦门大学杨朝勇教授和宋彦龄教授团队在《自然-生物技术》发表了题为“Spatially resolved profiling of extracellular vesicles in tissues with Spatial-EV-seq”的研究论文，他们开发的Spatial-EV-seq技术能够在组织切片上原位捕获细胞外囊泡并完整保留其空间分布，同时实现单个囊泡水平的多重蛋白质分子分型。

研究团队在玻璃片表面通过化学偶联反应构建了抗体修饰的捕获界面，将冰冻组织切片直接与该界面贴合进行印迹转移，组织中的囊泡通过表面抗原和抗体之间的亲和力被原位固定下来。囊泡本身的尺寸只有几十到一百多纳米，超出了常规光学显微镜的检测极限，为了解决这个问题，研究团队设计了针对CD63、EpCAM和PDL1等靶标蛋白的核酸适配体作为识别元件，这些适配体结合到囊泡表面后能够启动滚环扩增反应并生成由长链DNA自组装形成的纳米花结构，囊泡的尺寸和荧光信号在这个过程中同时得到了大幅提升。通过引入不同颜色的荧光探针进行杂交标记，研究团队能够在单个囊泡上同时检测多种蛋白质的表达情况，并根据不同颜色荧光信号的共定位为每个囊泡生成独特的分子身份信息。与传统的抗体直接荧光标记法相比，滚环扩增后的囊泡信号强度提升了13.4倍，检测效率在每2500平方微米视野0至700个囊泡的输入范围内呈现出良好的线性响应并且达到了约76.7%的检出率。研究团队将人黑色素瘤A375囊泡和人胶质瘤U251囊泡按不同比例混合后进行检测，发现该方法能够准确区分两种来源的囊泡亚群，即使双阳性囊泡在整个样本中的比例低至7.2%仍然能够被稳定检出。在健康小鼠肾脏和脾脏组织的验证实验中，Spatial-EV-seq捕获到的囊泡空间分布模式与组织切片免疫荧光染色显示的蛋白表达区域高度吻合，印迹转移过程中外源荧光标记囊泡的平均横向扩散距离仅为5.8微米，说明囊泡的原始空间位置在转移过程中得到了很好的保持。

研究团队将这项技术应用于4T1小鼠乳腺癌模型并系统比较了原发肿瘤、癌旁组织、肺转移灶和健康肺组织中的囊泡特征差异，结果发现肿瘤组织和肺转移灶中的PDL1阳性囊泡、EpCAM阳性囊泡以及Siglec-15阳性囊泡数量明显高于癌旁组织和健康肺组织，而反映免疫活性的CD62L阳性囊泡在肿瘤组织和转移灶中减少了约九倍。在抗PD1免疫治疗实验中，治疗后肿瘤边缘区域的免疫抑制性Siglec-15囊泡减少了4.08倍而核心区域仅减少了1.95倍，肿瘤促进性CSV囊泡在边缘减少了9.92倍而在核心减少了7.75倍，不过PDL1阳性囊泡和EpCAM阳性囊泡在核心区域的下降幅度反而更大，分别减少了7.84倍和8.70倍，边缘区域则分别下降了5.76倍和3.75倍，这些空间上的差异表明肿瘤不同区域的囊泡对免疫治疗有着不一样的响应动力学特征。

研究团队将Spatial-EV-seq获取的囊泡分布图像与相邻组织切片的空间转录组数据进行整合对齐，进而探索囊泡空间分布与细胞功能状态之间的关联。在治疗前的肿瘤样本中，根据PDL1阳性囊泡丰度的高低，CD8阳性T细胞被划分成了两个空间簇，高丰度区域的T细胞富集了T细胞分化和免疫抑制相关通路并且该区域的耗竭性CD8阳性T细胞呈现出更为活跃的配体-受体相互作用，低丰度区域的T细胞则主要与肿瘤发生通路相关。免疫治疗后，高PDL1阳性囊泡区域显著富集了代谢重编程相关通路，低丰度区域则富集了I型干扰素产生等免疫激活通路，并且高PDL1阳性囊泡区域的SPP1信号通路活性约为低丰度区域的两倍，而SPP1信号已知能够促进肿瘤细胞的上皮-间质转化并参与免疫抑制微环境的形成。细胞间通讯网络分析进一步揭示，高PDL1阳性囊泡区域形成了以耗竭性CD8阳性T细胞为核心的免疫抑制网络并且代表了免疫治疗抵抗的关键节点，低丰度区域则维持着免疫活性状态并对PD1阻断治疗更为敏感。在临床肝细胞癌活检样本中，PDL1阳性囊泡在肿瘤区域内分布并不均匀，囊泡丰度较高的区域恰好对应着CD8阳性T细胞和NK细胞浸润较少的部位，这种空间上的分离模式提示囊泡可能在局部微环境中独立于其亲本细胞而发挥作用，这项研究为理解细胞外囊泡在肿瘤微环境中的空间功能异质性提供了直接证据，也为癌症精准诊断和免疫治疗响应预测开辟了新的技术路径。

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