浙江
多糖作为四大类生物大分子之一，一般被认为是由内质网和高尔基体合成的，经分泌途径运输至细胞膜或细胞外空间发挥它的功能。但是，它们在细胞核内的存在与作用长期以来未被认知。近日，中山大学丁俊军教授团队在国际顶尖期刊《Nature Cell Biology》在线发表了题为“Nuclear N-glycosylation maintains H3K9me3 heterochromatin and genomic stability”的研究论文。该工作系统揭示了细胞核内核膜蛋白存在N-糖基化修饰，并阐明了这一修饰在维持H3K9me3异染色质和基因组稳定性中的关键调控作用。中山大学丁俊军/毛洋/西北大学孙士生为共同通讯作者。
研究团队首先利用质谱技术和自主开发的StrucGP软件，在小鼠全能样干细胞、小鼠和人的胚胎干细胞、小鼠前诱导多能干细胞以及小鼠胚胎成纤维细胞这五种不同细胞类型的细胞核中，均鉴定到了内核膜蛋白上的N-糖基化修饰。他们发现，SUN1、SUN2、TMPO和LEMD3这四种内核膜蛋白可以被高甘露糖型的N-聚糖所修饰。免疫荧光和免疫电镜实验进一步证实，N-糖基化信号确实定位于内核膜区域。用PNGase F酶去除N-聚糖后，这些信号显著减弱甚至消失，这为核内N-糖基化的存在提供了直观的证据。
为了在全基因组范围内研究N-糖基化的分布，丁俊军团队开发了一种名为GlycoChIP-seq的新技术。该方法利用凝集素ConA识别并结合N-糖基化，进而富集与之结合的染色质片段进行测序。分析结果显示，N-糖基化显著富集在核纤层相关结构域中，这些结构域是位于细胞核周边的异染色质区域。有意思的是，N-糖基化信号与抑制性组蛋白修饰H3K9me3的分布高度重叠，约百分之二十的N-糖基化 peaks与H3K9me3 peaks重合。研究团队通过药物抑制整体N-糖基化，或者对内核膜蛋白TMPO的N-糖基化位点进行定点突变，两种独立的干预策略均导致细胞内H3K9me3水平显著下降，并且下调的H3K9me3信号同样富集在核纤层相关结构域中。
进一步的机制研究发现，N-糖基化缺失会削弱内核膜蛋白TMPO与组蛋白甲基转移酶SETDB1之间的相互作用。SETDB1是催化H3K9me3修饰的关键酶。当N-糖基化受到抑制或TMPO的糖基化位点发生突变时，SETDB1从核膜区域解离，向核质内弥散分布。这种定位的改变直接导致了SETDB1依赖性的H3K9me3修饰在基因组特定区域尤其是LADs内减少。研究团队观察到，H3K9me3水平下降的区域中包含了大量LINE-1逆转座子。LINE-1是一种能够在基因组中“跳跃”的重复序列，通常被H3K9me3异染色质所沉默。然而，当N-糖基化受损后，LINE-1的转录水平则显著上升，其逆转座活性也随之增强。而LINE-1的激活会引起DNA双链断裂，细胞内的γH2A.X焦点数量明显增加，这表明基因组的稳定性受到了破坏。研究团队还在小鼠胚胎成纤维细胞中验证了上述现象。
此外，研究团队还探索了这些核内N-糖基化的来源。他们发现，经典的内质网N-聚糖生物合成途径参与了内核膜蛋白的糖基化过程。团队发现使用衣霉素抑制脂联寡糖的合成，或者用NGI-1抑制剂阻断寡糖转移酶的活性，以及敲低催化亚基STT3A，都能够显著减少内核膜上的N-糖基化信号和内核膜蛋白的糖基化水平。此外，负责内核膜蛋白在内质网中扩散的atlastin蛋白家族成员ATL2，以及参与核孔复合物转运的多个核孔蛋白，对于N-糖基化信号正确定位到内核膜也至关重要。
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