如何检测CAR-T、CAR-NK等疗法中的低频免疫细胞？

在CAR-T、CAR-NK等细胞治疗开发过程中，始终要回答一个问题：免疫细胞是否真正发挥了作用？

在CAR-T研究中，CAR分子在T细胞表面成功表达，并不代表着细胞具有理想的杀伤能力。细胞的数量、活率、纯度等指标也不能完全说明产品具有稳定的生物学效价。CAR-T细胞能不能被激活、识别靶点，并产生有效的T细胞免疫应答是细胞治疗的核心。这也是ELISpot技术在细胞治疗领域被关注的原因。

ELISpot（即酶联免疫斑点检测）在ELISA基础上结合细胞培养技术衍生出的高灵敏度免疫检测方法。它能够在单细胞水平检测分泌细胞因子的细胞频率。分泌靶因子的阳性细胞会在膜上形成可计数的斑点，反映出有多少个细胞参与了免疫应答。

一、ELISpot在CAR-T研发中的应用

CAR-T细胞疗法是通过基因修饰技术，将带有抗原识别结构域和T细胞激活信号的CAR导入T细胞，使其能够识别肿瘤细胞表面抗原，并通过释放穿孔素、颗粒酶B以及细胞因子等方式发挥抗肿瘤作用。

不同scFv、铰链区、跨膜区、共刺激结构域，都会影响CAR-T细胞的激活能力、细胞因子分泌谱、杀伤效率和持久性。研究人员将CAR-T细胞与靶癌细胞或靶抗原共培养，通过ELISpot检测CAR-T在受到抗原刺激后，是否分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子，为CAR-T临床治疗评估提供数据支撑。

Hu等人在开发靶向CD19的CAR-T疗法过程中，利用IFN-γ ELISpot分析11名患者外周血免疫反应情况，结果显示双敲除DKO和低免疫原性HIP的CAR-T细胞未激活T细胞，而野生型WT细胞强烈激活T细胞，并在第28天达到峰值。证实HIP CAR-T细胞不会引发免疫反应，有效逃避免疫系统的排斥反应。

ELISpot检测患者外周血的结果（源自文献：doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009）

二、横向比较：ELISpot vs. ELISA及流式细胞术

ELISA用于免疫反应的定性和定量检测，利用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线定量可溶性蛋白含量。流式细胞术（FCM）反映细胞某个瞬间的“静态快照”，是细胞通过固定和通透后检测到的细胞内部储存的蛋白量。ELISpot关注活细胞分泌蛋白总量随时间的累积结果，在检测低频细胞表达上比FCM灵敏。

ELISpot、ELISA、FCM怎么选？

在项目开发过程中，ELISpot可与ELISA、FCM形成互补，而不失相互替代。需要检测细胞因子总体分泌水平时，直接选用ELISA。如果需要了解细胞亚群与多参数信息，可能流式细胞术更合适。在检测低频抗原特异性功能应答时，就要优先考虑ELISpot了。

ELISpot

ELISA

流式细胞术

检测对象

分泌功能细胞

总体可溶性分子浓度

细胞表型、胞内分子、多参数特征

读出形式

离散斑点（SFU）

吸光度、浓度

细胞比例、荧光强度

单细胞分辨率

低频应答检测

优势明显

较弱

取决于总细胞数、目标细胞比例、信噪比

核心优势

灵敏、直观、适合功能评估

操作成熟、适合批量定量

信息维度高、可做亚群分析

主要局限

通量与多参数信息有限

缺少单细胞信息

仪器与分析门槛较高

三、ELISpot斑点如何分析？

“一个阳性细胞对应一个ELISpot斑点”，这是ELISpot检测的理论前提。并非所有斑点都可用于数据统计，符合标准的斑点有其自身特征。

1.圆形，有核晕结构

如示意图所示，标准的斑点呈圆形，中心颜色较深，边缘颜色逐渐变浅，类似“核晕效应”。ELISpot板孔中的细胞处于悬浮状态，分泌的细胞因子均匀的向四面八方扩散，没有方向性。扩散到孔底部的PVDF膜上时会被包被抗体捕获。路径越短，到达该点的细胞因子越多，斑点颜色就会越深。因此以垂直距离为中心点，以同心圆向外扩散，浓度和颜色逐步降低。

斑点的核晕结构

2.大小不均一，呈正态分布

ELISpot斑点的直径通常50-150μm。尽管在同一个孔中，阳性细胞培养条件和受到的刺激相同，但每个细胞分泌细胞因子或抗体的时间和能力不一定相同，因此产生的斑点也会大小不完全相同。如果对这些斑点的直径进行统计，会发现它们呈正态分布。当然，不同细胞、不同刺激物、不同分泌物形成的斑点（平均直径）也会存在差异，如IFN-γ、IL-4等细胞因子的斑点直径比IL-10、IL-12之类的大。

斑点大小不一，呈正态分布

假斑点或非特异性斑点一般形状不规则，颜色深浅不一，无核晕结构。凋亡细胞、细胞膜碎片、灰尘、纤维等可能会形成假斑点。在孵育和显色反应过程中洗板彻底会减少假斑点出现的频率。

四、义翘神州ELISpot试剂盒

ELISpot实验体系需要标准化。细胞活率、抗原刺激条件、阴性与阳性对照、洗板强度、显色时间、读板参数、背景扣除方式等都有可能影响读板结果（SFU值）。

义翘神州ELISpot检测试剂盒正是围绕这一痛点设计。其预包被ELISpot检测试剂盒经PVDF板包被、无菌干燥、真空密封包装等流程制备，可检测IFN-γ、IL-2、IL-4等多种关键细胞因子。试剂盒即用型预包被，具有重复性高、检测流程简单、超高灵敏度等特点，是检测人源或鼠源细胞因子优先考虑的标准化方案。

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