许锦波团队率先跑通低通量de novo，11大靶点上实现90%成功率！

在最新公开的一份技术报告中，AI 蛋白质设计平台公司分子之心宣布，他们构建的从头纳米抗体设计平台 MMDesign，在真实治疗靶点上跑通了一条此前几乎无人交卷的路线：在每个靶点仅实验测试 14–50 个候选分子的前提下，MMDesign 就在 11 个治疗相关靶点中的 10 个上成功找到特异性结合物，靶点级成功率约 90.9%，最佳测得亲和力达到皮摩尔（pM）级别。对一个长期被认为「没有高通量就很难有收获」的领域来说，这意味着低通量、跨多靶点的实用级 de novo 纳米抗体发现，第一次被跑成了一条完整可复用的流程。

更重要的是，这样的成绩并不是靠「选简单靶点刷数据」实现的。报告显示，MMDesign 在被公认为低通量场景下极难命中的浅层三聚体细胞因子 TNFα 上，实现了 14 选 7（50%）的命中率；在部分 GPCR 等被视为抗体设计「深水区」的高难度靶点上，同样获得了高表达、低聚集且特异性良好的候选。多数命中分子不仅亲和力达到纳摩尔甚至皮摩尔级别，还在 CHO 表达、SEC 单体比例和非特异性结合等可开发性指标上表现稳健——这意味着这些分子不仅「能绑得紧」，而且从一开始就带着成药性走进实验室。

支撑这一整套工作流的，是分子之心自研的全原子结构预测模型 MMFold。在抗体–抗原结构预测的权威基准 FoldBench 上，MMFold 的 Top‑1 成功率达到 68.6%，显著高于当前公开的 AlphaFold 3 等主流系统，Top‑5 成功率进一步提升至 75.6%。更准确、覆盖面更广的结构预测能力，让 MMDesign 在「从头生成 + 多轮过滤」的过程中拥有更可靠的结构信号，能够在数万级候选空间中，用几十次实验筛出过去往往需要高通量平台才能找到的高质量结合物。

这份技术报告由许锦波团队完成。许锦波是 AI 蛋白质结构预测领域最早的开拓者之一，早在 2016 年提出的 RaptorX‑Contact 方法，就率先证明深度学习可以显著提升蛋白质结构预测精度，被业界视为 AlphaFold 等系统的重要方法学前驱，多家媒体称他为「AI 预测蛋白质结构第一人」。如今，他带领分子之心试图把这套从 0 到 1 的基础研究成果，延伸到抗体和纳米抗体的从头设计与工程化应用。

综合这些结果，一个信号变得清晰：de novo 纳米抗体发现正在从「海量盲筛」的探索性范式，走向「可编程分子工程 + 低通量验证」的工程化范式。MMDesign 展示的是，在当下可用的 AI 和实验条件下，如何在保持跨靶点、含难靶的高命中率的同时，把实验负担压缩到「几十次验证」的量级。接下来，本文将按照技术报告原结构，对 MMDesign 的设计理念、算法实现和实验结果进行系统呈现。

摘要

传统的抗体发现依赖于动物免疫或大规模文库筛选，需要对数百万至数十亿候选物进行实验验证，且在表位特异性和分子性质方面的可编程性有限。生成式建模的最新进展已展示了从头设计抗体设计的可能性，但在治疗相关靶标上以低实验通量实现实验上实用的生物制剂发现仍然具有挑战性。

本文介绍了 MMDesign，一个 AI 生物药从头设计平台，结合了生成式序列 - 结构优化与多层计算过滤。仅从靶标蛋白和指定的表位残基出发，MMDesign 通过 MMFold（一种专有的抗体 - 抗原结构预测模型）的信心景观优化以及蛋白质语言模型，生成数万个纳米抗体候选物。过滤阶段结合了结构可靠性、序列自然性和基于物理的界面评估，将候选物池压缩至每个靶标仅数十个可进行实验测试的设计。我们在 11 个治疗相关靶标上系统评估了 MMDesign，涵盖细胞因子、免疫检查点、受体、病毒蛋白和表面抗原。每个靶标仅测试 14-50 个候选物，即可在 11 个靶标中的 10 个（90.9%）上获得确认的结合物，最佳测量亲和力范围从皮摩尔到纳摩尔水平，证明了在实验可处理规模上的广泛靶标级成功。值得注意的是，MMDesign 在 TNFα 上实现了 50% 的命中率，TNFα 是一种浅层三聚体细胞因子靶标，此前已被证明对低通量 de novo VHH 发现活动具有困难性。

这些结果共同表明，生物制剂发现可能正从大规模随机筛选转向可编程分子工程，其中计算生成和优先级排序大幅减少了实验负担，同时实现了快速的表位靶向治疗性结合物发现。

图形摘要

图 1：排名最高的 VHH 结合物（青色）与十个成功靶标（白色）的复合物预测结构。

1 引言

治疗性抗体发现仍然由大规模随机筛选主导，包括动物免疫和展示文库筛选，通常需要对数百万至数十亿变体进行实验 interrogation。尽管这些方法已产生许多成功的治疗药物，但它们在表位特异性和治疗性质方面的控制有限，并带来巨大的实验和时间成本。因此，计算生物制剂工程的一个核心挑战是抗体发现能否从随机筛选转向可编程分子生成和优化。

生成式建模的最新进展改变了 de novo 蛋白结合物设计的格局，RFdiffusion [1]、BindCraft [2] 和 AlphaProteo [3] 等系统证明了可以直接从靶标结构计算生成高亲和力结合物。然而，将这些进展扩展到抗体已被证明难度极高，因为抗体 - 抗原识别由构象柔性的 CDR 环和高度异质的结合界面主导。尽管如此，Chai-2 [4]、Germinal [5]、BoltzGen [6] 和 GeoFlow-V3 [7] 等近期系统已开始展示 de novo 抗体和纳米抗体发现的概念验证。

尽管取得了这些进展，实用的低通量抗体发现仍未解决。大多数当前系统在不同靶标间的成功率不一致，需要大量的实验探索，或尚未在困难的治疗性抗原上证明稳健的性能。特别是，很少有研究在报告广泛靶标级成功的同时，每个靶标仅实验测试数十个候选物。

本文介绍了 MMDesign，一个幻觉引导的 de novo VHH 发现平台，旨在以实验可处理的规模运行。仅从靶标蛋白和指定的表位残基出发，MMDesign 结合了序列和结构共生成与多层计算过滤，每个靶标仅产生数十个实验候选物。在 11 个治疗相关靶标上系统评估了 MMDesign，涵盖细胞因子、免疫检查点、受体、病毒蛋白和表面抗原。每个靶标仅实验测试 14-50 个候选物，即可在 11 个靶标中的 10 个（90.9%）上获得确认的结合物，最佳测量亲和力范围从皮摩尔到纳摩尔水平。值得注意的是，MMDesign 在 TNFα 上实现了 50% 的命中率，TNFα 是一种三聚体细胞因子靶标，此前已被证明对低通量 de novo VHH 发现工作极具挑战 [4, 6]。这些结果共同表明，生成式纳米抗体发现正开始从概念验证演示转向实用的治疗性发现模式。

2 结果

2.1 跨治疗多样性靶标的实用 De Novo VHH 发现

为评估生成式纳米抗体发现是否能在实验实用规模上运行，我们在系统评估 MMDesign 的同时，每个活动仅实验测试 14-50 个候选分子。

基准 panel 的靶标多样性和结构复杂性。本研究评估的靶标 panel 涵盖了广泛的治疗相关蛋白类别，代表了近期 de novo 抗体或纳米抗体设计系统报告的最具结构和生物学多样性的基准集之一。十一个靶标包括细胞因子（TNFα、IL-2、IL-3、IL-20）、免疫检查点（PD-1、PD-L1）、受体胞外域（InsulinR、PDGFR、IL-7Rα）、病毒蛋白（BHRF1）和表面抗原（CD7），共同覆盖免疫学、肿瘤学、代谢和传染病应用。与许多主要关注有限演示抗原集的近期生成式抗体设计研究不同，MMDesign panel 更接近真实治疗性生物制剂发现中遇到的多样性。

重要的是，基准多样性超越了生物类别，包括界面几何和结合难度的显著变化。TNFα 代表了一个特别具有挑战性的案例，因为它形成了一个同源三聚体细胞因子复合物，具有浅层且溶剂暴露的结合表面，这一靶标类别在历史上被证明对低通量生成式结合物设计具有困难性。InsulinR、PDGFR 和 IL-7Rα 等受体靶标通过其大型柔性胞外域和异质表面拓扑引入了额外的复杂性。这些靶标共同跨越了多个结合模式，包括浅层暴露的沟槽、柔性受体界面、检查点相互作用表面和病毒表位。因此，MMDesign 基准不仅评估平台是否能生成结合物，还评估其是否能跨结构不同且治疗性现实的抗原类别进行泛化。

候选 VHH 通过幻觉引导的序列 - 结构优化生成，随后进行多层计算过滤，结合了结构可靠性分析、序列自然性评估和基于物理的界面评分。

在 11 个活动中，10 个靶标（90.9%）获得了确认的特异性结合物。每个靶标的实验测试仅涉及数十个候选物，但产生了 2.3% 至 86.7% 的每靶标命中率（表 1）。最佳测量亲和力范围从皮摩尔到微摩尔水平，多个活动产生了低至中纳摩尔范围内的结合物。在所有成功的活动中，预测的复合物结构表明设计的 CDR 残基与用户指定的表位热点残基之间存在直接接触。

在所有靶标中，PD-L1 实现了最高的命中率，30 个测试候选物中有 26 个被确认为特异性结合物，最佳测量 K_D 为 7.2 nM。其他活动在多种抗原类别上产生了多个确认的结合物，包括 InsulinR（5/25，最佳 K_D 25 nM）、BHRF1（5/35，最佳 K_D 282 nM）、IL-2（5/50，最佳 K_D 138 nM）和 IL-3（2/25，最佳 K_D 约 200 nM）。PDGFR、IL-7Rα、IL-20 和 PD-1 也分别鉴定出单个确认的结合物。只有一个靶标 CD7 在当前管线配置下未产生确认的结合物。

表 1：所有 11 个靶标活动的实验验证结果

这些结果共同表明，MMDesign 能够在每个靶标仅实验测试数十个候选物的情况下实现广泛的靶标级成功，表明生成式 VHH 发现可能越来越多地在实验可处理的规模上运行。

对设计复合物的结构分析表明这些结合物是真正新颖的：11 个靶标中的 9 个在 PDB 中没有已知的 VHH 复合物，并且这些设计占据了此前未被表征的结合姿态空间（附录 C）。同时，对于存在验证参考的靶标，尽管 CDR 完全是 de novo 的，设计仍收敛于相同的功能表位 —— 包括恢复自然的 PD-1:PD-L1 抑制性界面。

2.2 MMDesign 在困难的 TNFα 靶标上实现 50% 命中率

TNFα 是一种同源三聚体细胞因子，其浅层且溶剂暴露的结合表面在历史上被证明对低通量 de novo VHH 发现方法具有困难性 [4, 6]。文献中报道的先前生成式纳米抗体活动在类似的有限实验通量设置下未能针对该靶标产生确认的结合物。

为在该挑战性系统上评估 MMDesign，通过幻觉引导生成管线优化了所有三个 CDR 环，并选择了 14 个候选物进行实验表征。七个设计（50%）通过 BLI 表现出清晰且特异性的靶标结合。先导分子实现了 51 pM 的表观 K_D，注意到该值反映了与三聚体 TNFα 分析物相关的亲合力增强。

TNFα 活动特别引人注目，因为它在极其有限的实验探索下展示了实质性的富集。计算管线成功地将数万生成的候选物缩小到少量实验可处理的集合，富集了真正的结合物。这些结果表明，AI 引导的生成式发现可能越来越多地触及历史上抵抗低通量发现工作流的困难治疗性几何结构。

选定靶标的代表性预测结构和 BLI 传感图如图 2 所示。

图 2：计算优先级排序的 VHH 候选物的实验验证。对于每个靶标，显示了预测的 VHH - 抗原复合物结构（左）和多浓度 BLI 传感图及 1:1 全局拟合（右）。

2.3 设计的 VHH 展现出良好的初步可开发性特征

除结合活性外，许多设计的 VHH 展现出令人鼓舞的初步可开发性相关性质。各活动的表达量表明，许多候选物可以作为 VHH-Fc 构建体在 CHO 细胞中稳健表达（图 3）。尺寸排阻色谱进一步显示，许多纯化的候选物主要保持单体状态，聚集特征有限（图 4）。

为评估初步特异性特征，对一部分设计的 VHH 进行了针对人血清白蛋白（HSA）的脱靶结合评估，HSA 是血浆中最丰富的蛋白质，也是治疗性抗体开发中非特异性相互作用的常见来源。在所有测试的候选物中，针对 HSA 的 BLI 响应在微摩尔浓度下保持最小，没有可测量的强非特异性结合证据（图 5）。针对胰岛素和 dsDNA 的额外多反应性 ELISA 实验同样表明了低水平的广泛非特异性反应性。

尽管这些实验不构成全面的治疗性可开发性评估，但它们表明 MMDesign 能够生成实验可处理的类抗体分子，而不仅仅是孤立的结合序列。这些观察表明，未来的生成式生物制剂系统可能同时优化结合活性、特异性、表达、稳定性和下游治疗性可开发性特征。

图 3：所有靶标活动中 VHH-Fc 构建体的表达量（mg/L）。每个数据点代表一个在 10 mL 规模的 CHO 中表达的设计候选物。

图 4：代表性 VHH-Fc 候选物的 SEC-HPLC 色谱图。主峰表示单体 VHH-Fc 物种；如有次要峰，则对应聚集体或降解产物。

图 5：七个设计的 VHH 候选物在 1-2 μM 浓度下针对 HSA 的 BLI 传感图。虚线标记从结合到解离的过渡。蓝色：实验响应；黑色：1:1 动力学拟合。

2.4 多层计算过滤富集实验命中发现

对计算过滤管线的 post-hoc 分析揭示，没有任何单一指标足以跨靶标稳健地识别最高质量的结合物。特别是，ipTM 和 pLDDT 等结构预测信心指标与确认结合物中实验测量亲和力之间的相关性有限，与先前的观察一致，即信心指标可能主要作为结合兼容性的粗略二元指标，而非定量亲和力预测因子。

相反，多层过滤标准的分层整合始终比任何单独指标产生更强的富集。过滤级联包含四个主要组成部分：(i) 结构信心评估，(ii) 跨随机种子和预测模型的可重复性分析，(iii) 基于蛋白质语言模型的序列自然性评估，和 (iv) 基于内部统计物理的界面评分。通过所有过滤阶段的设计相对于使用任何单一标准选择的候选物，在实验确认的结合物方面实现了实质性的富集。

这些观察表明，实用 AI 原生生物制剂发现中的核心挑战不仅仅是生成候选序列，而是充分富集真正的结合物以最小化实验负担。在这一背景下，多目标计算优先级排序似乎在启用实验实用的低通量发现工作流中发挥着关键作用。

2.5 MMFold 在抗体 - 抗原复合物预测中实现高精度

由于幻觉引导优化依赖于抗体抗原复合物结构预测的质量，我们在 FoldBench [8] 抗体 - 抗原基准数据集上评估了 MMFold。MMFold 是一种受 AlphaFold3 架构 [9] 启发并使用增强的抗体 - 抗原建模能力训练的专有全原子结构预测模型。MMFold 在 2021 年 9 月 30 日之前发布的蛋白质数据库 [10] 条目上进行了训练。

在 172 个抗体 - 抗原界面上，MMFold 的 Top-1 预测实现了 68.6% 的整体 DockQ [11] 可接受或更好的成功率，而 AlphaFold3 在相同基准上为 47.9%。在中等和高质量 DockQ 阈值方面也观察到了改进。扩展到 Top-5 预测时，MMFold 进一步将可接受或更好的性能提高到 75.6%（图 6）。MMFold 的准确性也随采样预测数量的增加而良好扩展。例如，当使用数百个种子时，MMFold 可能在 Top-5 预测中实现约 50% 的高分辨率成功率。

几个最近发布的结构预测模型未包含在此比较中。Boltz-2 [12] 被排除，因为其更近的训练截止时间与 FoldBench 发布窗口的部分重叠，这排除了在该基准上的无泄漏评估；值得注意的是，作者自己报告「Boltz-2 显示了对 Boltz-1 的改进，但仍落后于 AlphaFold3。」Protenix-v2 [13] 报告 Top-1 预测的 DockQ 可接受或更好成功率为 65%，但该数字是在 FoldBench 抗体 - 抗原基准的 103 个 PDB ID（160 个界面）子集上获得的，而非此处使用的完整 113 个 PDB ID（172 个界面）集。因此，它与图 6 中的结果不直接可比，未包含在内。

图 6：基于 DockQ 分类的 MMFold 与领先结构预测模型的性能比较。堆叠条形图展示了高（黄色）、中（青色）和可接受（粉色）质量阈值下的累积成功率（%）。MMFold 在 Top-1 和 Top-5 成功率的所有质量等级上均显著高于基线，包括 AlphaFold3、Boltz-1、Chai-1、HelixFold3、Protenix-v1 [14] 和 ESMFold2 [15]。标有星号（Protenix-v1 * 和 ESMFold2*）的值在 FoldBench 抗体 - 抗原基准上从 ESMFold2 论文 [15] 报告和推断；ESMFold2 结果对应其 20-loop 推理设置。所有其他模型在单一一致协议下进行了评估。

代表性案例研究展示了相对于 AlphaFold3 在多个抗体 - 抗原复合物中 substantially 改进的界面建模，包括 MMFold 准确恢复基线系统建模不佳的结合几何结构的示例（图 7）。详细的基准程序和额外的基准分析见补充信息。

图 7：说明抗体 - 抗原蛋白复合物预测准确性的案例研究。实验真实结构（左列）以实体灰色显示。在预测面板中（中：AlphaFold3；右：MMFold），预测模型按亚基着色 —— 抗原为红色 —— 并叠加在半透明真实结构上以可视化结构偏差。

尽管当前研究未直接建立结构预测准确性与实验发现成功之间的因果关系，但这些结果表明，改进的抗体 - 抗原结构建模可能为下游生成式生物制剂优化工作流提供更高质量的信心景观。

3 讨论

生成式建模的最新进展已确立了 de novo 抗体和纳米抗体生成的可能性。本文呈现的结果表明，该领域可能正开始从概念验证演示转向实验实用的发现工作流。在 11 个治疗相关靶标上，MMDesign 在仅实验测试每个活动 14-50 个候选物的情况下，在 10 个靶标上产生了确认的结合物，涵盖细胞因子、免疫检查点、受体、病毒蛋白和表面抗原。这些发现表明，生成式 VHH 发现越来越多地以实验可处理的规模运行，而非依赖大规模的随机筛选活动。

实用 AI 原生生物制剂发现的一个决定性特征可能最终是在保持广泛靶标级成功的同时大幅压缩实验筛选负担的能力。传统的抗体发现工作流，包括动物免疫和展示文库筛选，通常需要探索数百万至数十亿变体，并对表位特异性提供有限的控制。相比之下，MMDesign 仅从靶标蛋白和用户指定的表位残基出发，计算生成数万个候选 VHH，并通过分层计算富集将此空间缩小到仅数十个实验设计。

更广泛地说，这些结果表明生物制剂发现可能从随机实验筛选转向可编程分子工程。

设计结合物的序列新颖性

任何生成式设计平台的一个关键考虑是其输出序列是否代表真正新颖的分子，还是仅仅重复已知的抗体。MMDesign 生成核心是一个通用全原子结构预测模型，未专门针对抗体 - 抗原复合物进行微调；基于幻觉的优化探索模型的信心景观，而不参考任何抗体序列数据库。因此，生成过程不能 —— 从构造上 —— 复制或衍生来自现有结合物的序列，无论是存储在公共数据库还是披露在专利申请中的序列。CDR 相似性分析（附录 A）和与 SAbDab 的结构比较（附录 B）确认，设计的序列与已知抗体实质性不同，框架区域保留了规范的 VHH 支架几何结构（每个区域的 Cα-RMSD 始终低于 0.7 Å），而 CDR 环 —— 特别是 CDR3—— 采用了在实验数据库中很大程度上不存在的构象。与已知 PDB 复合物的结合姿态比较（附录 C）提供了结构新颖性的进一步证据：11 个靶标中的 9 个在 PDB 中没有纳米抗体复合物，因此设计的 VHH 占据了此前未被表征的结构空间。在存在验证参考的情况下，尽管 CDR 完全是 de novo 的，设计独立地收敛于相同的功能表位 ——TNFα 设计恢复了 5M2J 表位（质心距离 1.03 Å），PD-1 设计落在自然 PD-1:PD-L1 界面上（质心距离 0.79 Å，24 个接触中的 14 个共享），与竞争性抑制机制一致。

TNFα 活动的意义

TNFα 活动在此背景下特别引人注目。TNFα 是一种同源三聚体细胞因子，具有相对浅层且溶剂暴露的结合表面，这在历史上被证明对低通量 de novo VHH 发现工作具有挑战性。在本研究中，仅实验测试 14 个候选物就产生了 7 个确认的结合物，对应 50% 的命中率，先导分子在亲合力增强的三聚体设置中达到 51 pM 的表观 K_D。尽管需要进一步的表征来评估这一结果的普适性，但它表明幻觉引导生成可能开始触及历史上抵抗计算低通量发现方法的困难抗原几何结构。

可开发性特征

当前研究的另一个值得注意的方面是许多设计的 VHH 展现出超越靶标结合 alone 的良好初步可开发性相关性质。在各活动中，许多候选物在 CHO 细胞中实现了稳健的重组表达，通过 SEC-HPLC 保持主要为单体状态，并在 BLI 检测中显示出针对 HSA 的最小可检测交叉反应性。尽管这些测量不构成全面的可开发性评估，但它们表明生成式发现系统可能越来越能够产生实验可处理的类抗体分子，而不仅仅是孤立的结合序列。更广泛地说，这些观察提出了未来生成式抗体平台可能不仅优化结合活性，而且同时优化表达、稳定性、特异性和下游治疗性可开发性的可能性。

生成与过滤的整合

当前研究还突出了在统一工作流中整合生成和计算过滤的潜在重要性。Post-hoc 分析表明，没有任何单一指标 —— 包括 ipTM 或 pLDDT 等结构预测信心指标 —— 足以跨靶标稳健地识别最高质量的结合物。相反，结构可重复性分析、序列自然性评估、表位接触验证和基于物理的界面评估的分层组合始终比任何单独标准提供更强的富集。这些观察表明，实用的生成式抗体发现可能不仅取决于生成能力本身，还取决于能够将大型计算候选空间过滤为实验可操作的集合的有效多目标优先级排序策略。

局限性与未来方向

仍存在几个局限性。首先，尽管在多种靶标上展示了确认的结合，但亲和力在各活动间仍然可变，许多成功的结合物聚集在纳摩尔范围内，而非始终实现亚纳摩尔效力。提高跨不同抗原类别的亲和力一致性仍然是未来模型开发的主要目标。其次，当前研究主要依赖于预测的复合物结构和结合检测；设计抗体 - 抗原界面的实验结构验证对于建立生成结合几何结构的准确性和理解成功设计 underlying 的机制将非常重要。第三，虽然初步表达和特异性测量令人鼓舞，全面的治疗性可开发性评估 —— 包括长期稳定性、聚集抗性、免疫原性和体内药代动力学分析 —— 超出了本工作的范围。

几个方向正在积极开发中。抗体 - 抗原结构建模和生成式优化的持续改进可能使平台能够解决日益困难的靶标类别，包括多特异性生物制剂、GPCR 和其他膜蛋白。超越 de novo 结合物生成，初步内部结果表明 MMDesign 可能可扩展到更高级的抗体工程设置，包括上下文或 pH 依赖性结合优化。同时，扩展设计 - 实验反馈循环可能逐步将抗体发现转变为自我改进的闭环优化过程，其中实验结果持续改进生成和过滤性能。最后，纳入更广泛的可开发性感知目标可能允许未来系统不仅优化结合，而且从分子生成的最早阶段就优化可制造性和治疗适用性。

综上所述，这些结果表明 de novo 纳米抗体生成可能越来越多地从探索性研究模式演变为实用的治疗性发现模式。如果生成、过滤和实验反馈的持续改进能够得以保持，计算引导的抗体发现可能最终从大规模随机筛选转向可编程分子工程。

可用性

MMDesign 平台可用于与制药和生物技术合作伙伴的协作靶标活动。MMFold 作为 MoleculeOS 的功能在 mos.moleculemind.com 上可用。

贡献者

MoleculeMind AI 与生物制剂工程团队。

实验验证由 MoleculeMind 生物制剂和转化团队完成。

* 通讯作者：Jinbo Xu, jinboxu@moleculemind.com

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附录

A 设计 VHH 序列针对已知抗体数据库的 CDR 相似性分析

• A.1 方法

为评估设计序列相对于已知抗体序列的新颖性，我们对 338 个 VHH 序列进行了 CDR 相似性分析，涵盖 11 个靶标系统，并额外检查了每个系统中亲和力最高的 VHH 候选物。

设计序列首先针对本地 PDB 蛋白质序列数据库（1,043,893 条蛋白质链）使用 blastp（BLAST+ v2.15.0，E 值 < 10⁻⁵，每个查询前 5 个命中）进行搜索。对于来自同一 PDB 条目的命中，仅保留一致性最高的链。然后使用 ANARCI 通过 IMGT 方案对查询和命中序列进行编号。通过基于 IMGT 编号对齐位置并记录错配、插入和删除，统计 CDR1（IMGT 27-38）、CDR2（IMGT 56-65）和 CDR3（IMGT 105-117）内的残基级差异。对于每个设计序列，选择整体序列一致性最高的 PDB 命中作为比较参考。

为进一步评估超越结构表征蛋白的新颖性，使用 blastp（E 值 < 10⁻⁵，前 20 个命中）将来自 11 个靶标系统中 10 个（不包括 CD7，未鉴定出实验确认的结合物）的最高亲和力 VHH 候选物额外针对 NCBI 非冗余蛋白质数据库（nr，约 2.5 亿条序列）进行搜索。选择一致性最高的条目，并使用相同的基于 IMGT 的方法计算 CDR 突变。手动审查前几个命中，以确定数据库中是否存在靶向相同抗原的已知 VHH 或纳米抗体。

为评估针对更广泛的自然观察抗体库空间的序列新颖性，使用 jackhmmer（HMMER 3.3，1 次迭代，E<10⁻⁴，每个查询最多 9,999 个命中）将所有 338 个设计 VHH 序列额外针对观察抗体空间（OAS）重链数据库进行搜索。OAS 是一个源自高通量 B 细胞受体测序研究的抗体序列精选存储库。由于 VHH 域在结构上等价于重链可变区，仅使用重链子数据库进行此比较；排除轻链条目。设计序列与每个 OAS 命中之间的一致性计算为对齐位置（不包括相对于查询的插入）与查询残基匹配的比例。然后对每个靶标系统内所有设计序列的每序列统计进行汇总。

• A.2 结果

所有设计序列的 CDR 突变统计汇总于表 2，每个系统的最高亲和力 VHH 候选物见表 3（CD7 从表 3 和表 4 中排除，因为未鉴定出具有实验确认结合亲和力的 VHH 候选物）。

针对最高亲和力 VHH 候选物每个系统的 NCBI nr 搜索结果（不包括 CD7）见表 4。

PD-L1 结合物在 PDB 中显示出与已知结构的最高同源性（抗 PD-L1 VHH，PDB：7czd），序列一致性为 92.2%，仅 9 个 CDR 突变。对于其余 10 个系统，最高命中一致性低于 81%，最高亲和力候选物的 CDR 总突变数为 7 至 31，与表 2 中的群体水平统计一致。在所有系统中，CDR3 始终携带最大数量的突变，与其作为抗原结合多样性主要决定因素的角色一致。

搜索更广泛的 NCBI nr 数据库确认了 11 个靶标中的 6 个（IL-2、IL-3、IL-20、PDGFR、BHRF1 和 InsulinR）在公共序列数据库中没有先前报道的 VHH 或纳米抗体，表明这些靶标的设计候选物不是先前披露序列的直接衍生物。

为在区域层面量化新颖性，将每个设计序列与 E 值最低（即检索到的 9,999 条序列中最接近的序列匹配）的 OAS 重链命中进行比对，并分别计算每个 IMGT 编号 CDR 和 FR 区域的突变。区域水平统计见表 5（每个系统的所有设计序列）和表 6（每个系统的最高亲和力候选物，不包括 CD7）。

表 2：所有设计序列与其最佳 PDB 命中的 CDR 突变统计（IMGT 编号）

表 3：每个系统最高亲和力 VHH 候选物与其最佳 PDB 命中的 CDR 突变数（IMGT 编号）

表 4：每个系统最高亲和力 VHH 候选物与其在 NCBI nr 中最近匹配的 CDR 突变数（IMGT 编号）

表 5：所有设计 VHH 序列与其最佳 OAS 重链命中的 CDR 和 FR 突变统计（IMGT 编号）

表 6：每个系统最高亲和力 VHH 候选物与其最佳 OAS 重链命中的 CDR 和 FR 突变数（IMGT 编号）

B 实验验证 VHH 设计与 SAbDab 的结构相似性

将 MMFold 预测的 VHH 结构（11 个靶标系统的 363 个设计）与 3,313 个 SAbDab 实验抗体结构使用成对 Cα-RMSD 进行比较。对于每个设计，执行全局 Needleman-Wunsch 序列比对，然后在所有对齐的 Cα 原子上进行单次 Kabsch 刚体叠加。然后在固定叠加下（不重新对齐）计算每个区域的 RMSD（IMGT 方案：FR1-FR4，CDR1-CDR3）。通过最小整体 RMSD 识别每个设计的最近 SAbDab 邻居。

实验验证的 VHH 序列（确认的结合物和其他湿实验表征的候选物）通过精确序列同一性与 MMFold 预测记录匹配。表 7 显示了每个实验验证 VHH 的整体和每个区域的 RMSD 及其最近的 SAbDab 结构。表 8 给出了每个系统内所有设计的系统水平平均值，作为群体参考。框架区域（FR1-FR4）在所有系统中始终低于 0.7 Å，确认了规范的 VHH 支架几何结构。CDR3 主导结构新颖性：PDGFR、InsulinR 和 IL-3 中高于 3 Å 的值表明在实验数据库中很大程度上不存在的环构象，而 TNFα、PD-L1 和 PD-1（<2 Å）与已知抗体环紧密对齐。实验验证的设计在大多数情况下与其系统平均值匹配或优于其系统平均值；PD-L1 是例外（0.61 vs. 平均值 0.48 Å），因为整个 PD-L1 系统已经收敛于 SAbDab 附近。

这些分析表明 MMDesign 不会恢复先前已知的纳米抗体序列或已知结合物的简单变体。相反，该平台生成 VHH 样但序列发散的 CDR 架构，包括靶向没有公共抗体、结构或专利数据库中接近已知对应物的靶标特异性结合物。

表 7：每个实验验证 VHH 设计与其最近 SAbDab 邻居的每个区域 RMSD（Å）

表 8：每个系统内所有设计的平均每个区域 RMSD（Å），每个设计均针对其最近的 SAbDab 邻居进行评估。

C 设计 VHH 的结构新颖性：与已知 PDB 复合物的结合姿态比较

VHH 序列是针对 11 个靶标 de novo 设计的，其中 9 个靶标在 PDB 中没有现有的 VHH 复合物结构（BHRF1、CD7、IL-2、IL-20、IL-3、IL-7Rα、InsulinR、PD-1、PDGFR）；只有 PD-L1 和 TNFα 有已知的 VHH 复合物可供比较。本分析提供定量的结合姿态比较，以证明：(1) 对于缺乏 VHH 参考的靶标，设计的 VHH 占据此前未被表征的结构空间，同时靶向功能相关的表位；(2) 对于有已知 VHH 结构的靶标，设计的 VHH 尽管 CDR 序列完全是 de novo 的，但显示与参考 VHH 相同的结合模式，确认了设计的有效性。

• C.1 方法

参考结构检索 对于每个靶标，使用靶标蛋白序列通过序列相似性搜索（同一性阈值 80%）从 RCSB PDB 检索已知复合物结构，并与 SAbDab 数据库交叉注释，将条目分类为 VHH 复合物、IgG/Fab 复合物或天然蛋白 - 蛋白复合物。

步骤 1：抗原链识别 参考结构中的每条蛋白质链使用局部成对比对（Biopython PairwiseAligner，局部模式）与靶标序列对齐；归一化到查询长度的比对分数用作同一性度量，得分最高的链被指定为抗原链（排除同一性 < 0.4 的结构）。局部比对正确处理查询序列是较长 PDB 链子域的情况（例如全长受体的胞外域）。

步骤 2：抗原链叠加 每个参考结构的抗原链叠加到设计复合物的链 A（靶标蛋白）上：

1. 对两个抗原链执行全局成对比对；提取无间隙匹配位置产生的 Cα 原子对（至少要求 10 对）。

2. 通过奇异值分解（SVD）计算最小化 Cα RMSD 的最优旋转矩阵 R 和平移向量 t。

3. 将变换（R, t）应用于参考结构的所有原子，保留复合物中所有链的相对几何结构。

叠加后，参考结合物链在设计坐标系中的位置代表其相对于靶标的真实结合姿态。

步骤 3：界面残基识别 使用 5 Å 重原子距离截断定义界面残基：如果残基的任何重原子位于对侧链任何重原子的 5 Å 范围内，则将该残基分类为界面残基。这产生两组：E_design（设计 VHH 接触的靶标残基，根据设计结构编号）和 E_ref（参考结合物接触的靶标残基，根据参考结构编号）。

步骤 4：结合姿态指标

(2) 接近向量角度。对于每个结合物，接近向量定义为从表位质心指向结合物质心的单位向量：

(3) Jaccard 相似性。表位残基重叠通过 Jaccard 指数量化。由于残基编号方案在设计结构和参考结构之间经常不同（观察到最多 + 35 的偏移），直接比较残基编号产生系统性假阴性。因此 E_design 和 E_ref 中的残基在计算前先映射到源自两个抗原链序列比对比对列：

J ∈ [0, 1]；较高的值表示两个结合物接触的靶标残基重叠更大。

• C.2 结果

表 9：所有靶标的结合姿态指标（仅有效比较）

• C.3 关键发现

1. 九个靶标在 PDB 中没有已知的 VHH 复合物结构。BHRF1、CD7、IL-2、IL-20、IL-3、IL-7Rα、InsulinR、PD-1 和 PDGFR 在公共结构数据库中没有已沉积的纳米抗体复合物，表明这些靶标的设计 VHH 结合模式无法直接与实验 VHH 参考进行基准比较。

2. 设计的 PD-1 VHH 与天然 PD-1:PD-L1 相互作用界面实质性重叠。与 PD-1:PD-L1 共晶结构（3BIK）的比较产生 0.79 Å 的质心距离、19.5° 的接近角度和 0.56 的 Jaccard 重叠系数。残基级分析进一步显示 24 个 VHH 接触残基中的 14 个（58%）与天然 PD-L1 结合界面共享，与潜在竞争性抑制机制一致。这些结果共同表明 MMDesign 独立收敛于功能相关的抑制性界面。

3. PD-L1 和 TNFα 设计确认了验证功能表位处的序列新颖性。对于两个有已知 VHH 参考的靶标，设计的 VHH 占据与现有 VHH 相同的功能表位（PD-L1：质心距离 0.7-2.3 Å；TNFα/5M2J：1.03 Å），同时具有与参考 VHH 无直接同源性的完全 de novo CDR 序列，展示了序列水平的新颖性。

设计的 TNFα VHH 与参考 TNFα VHH（5M2J）在 10 个对齐的 CDR 位置上有差异，包括两个插入 / 删除事件，表明抗原识别区域存在实质性分歧而非简单地对现有结合物进行点替换。也就是说，MMDesign 能够通过 de novo 生成的抗原识别序列独立恢复治疗性验证的结合解决方案，尽管在模型训练期间未接触专利参考。

设计的 PD-L1 VHH 与参考（7CZD）在 9 个 CDR 位置上有差异。PD-L1 活动表明 MMDesign 能够通过独立生成的 VHH 序列可重复地恢复治疗性验证的表位几何结构，支持设计过程的生物学现实性。

4. 几个靶标显示与可用 IgG/Fab 参考结构不同的结合模式。IL-2（接近角度 67°-80°）、IL-20（质心距离 14.7 Å）和 BHRF1（接近角度 123°）的设计 VHH 与 PDB 中可用的 IgG/Fab 复合物存在实质性分歧，表明这些设计从检索到的参考抗体结构未代表的取向接合靶标。

D 方法

• D.1 设计概述

MMDesign 管线遵循「生成 - 然后 - 过滤」策略，包含四个阶段：靶标准备、序列 - 结构生成、计算过滤和实验表征。在生成阶段，结构预测模型在幻觉范式 [16] 中运行，从指定的表位共同生成 VHH CDR 序列和全原子复合物结构，每个靶标产生数万个候选物。在过滤阶段，覆盖序列可表达性、结构可靠性和基于物理的结合评分的多层计算过滤器逐步将候选物池减少到数十个用于湿实验测试的设计。整体工作流如图 8 所示。

• D.2 靶标准备

每个活动仅需抗原序列和一组表位热点残基位置。VHH 支架模板和 CDR 环长度可由用户指定或自动分配。

• D.3 序列 - 结构生成

生成核心在幻觉范式中运行：给定抗原序列、热点位置和 VHH 支架，CDR 序列通过结构预测模型和蛋白质语言模型的反向传播优化自定义损失函数。这些损失编码了包括表位接触、界面质量、结构合理性和序列自然性在内的设计目标，引导序列朝向信心景观中对应于高质量预测复合物的区域。框架区域在整个优化过程中保持不变。每个活动产生数万个候选 VHH 序列。

• D.4 计算过滤

过滤级联评估三个连续标准，每个标准针对不同的失败模式：

结构可靠性。可靠性沿四个互补轴评估：(a) 单一结构预测器的信心指标（如 pLDDT、ipTM），(b) 跨同一模型的多个随机种子的可重复性，(c) 两个或更多独立预测架构之间的一致性，和 (d) 表位接触验证：在预测的复合物结构中，检查 CDR 残基是否与指定的热点位置直接接触。在种子或模型扰动下产生分歧构象的设计被降低优先级。

可表达性。蛋白质语言模型评估序列自然性，表面性质过滤器去除具有升高聚集倾向的设计。

结合特异性。内部开发的基于物理的评分函数估计结合自由能，并评估预测的界面是否表现出与特异性分子识别一致的特征。

在所有三个层级之后，初始的数万池被缩小到数十个用于湿实验测试的设计。当通过所有过滤的候选物数量超过实验预算时，使用相同的评分函数对最终选择进行排名和优先级排序。

图 8：MMDesign 生物制剂发现工作流。候选 VHH 序列和结构通过基于幻觉的优化生成（设计），通过多层计算过滤（过滤），通过 BLI 结合检测验证（实验），并通过动力学分析表征（分析）。

• D.5 实验表征

蛋白质表达与纯化

将人 IgG1 的 CH2 和 CH3 序列融合到每个设计 VHH 的 C 末端。VHH-Fc 构建体在 CHO 系统中以 10 mL 规模表达 5 天；收集上清液并使用 Protein A 磁珠纯化。通过还原条件下的 SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 确认纯度。

结合表征

使用 Gator Pivot 仪器通过生物层干涉法（BLI）进行多循环动力学检测。

初级结合命中筛选

将携带 His 标签的靶标蛋白和 HSA 分别固定在单独的 NTA 生物传感器上，将 VHH 作为分析物以单一高浓度（2,000 nM）施加。表现出靶标结合但不与 HSA 结合的候选物被分类为特异性结合物。检测序列为：60 秒基线 1、120 秒上样（靶标位移 0.5 nm）、120 秒基线 2、180 秒结合相、300 秒解离相、30 秒再生和中和。

K_D 测定

将初级筛选中的命中推进到定量亲和力测量。通过人 IgG1 Fc 标签将 VHH 固定在 HFCII 生物传感器上，将靶标蛋白作为分析物以 2 倍稀释的四至七点系列施加，实现精确的动力学拟合。检测序列为：60 秒基线 1、120 秒上样（靶标位移 1.5 nm）、120 秒基线 2、180 秒结合相、300 秒解离相、30 秒再生和中和。

通用条件

所有步骤在 25°C 下进行，使用 10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA 和 0.05% 表面活性剂 P20（pH 7.4）作为运行缓冲液。包括阴性对照（仅缓冲液样品）用于基线扣除。数据以 10 Hz 收集，并在所有浓度上全局拟合到 1:1 结合模型以获得 K_D。

多反应性评估

为确认结合由特异性表位相互作用而非非特异性静电相互作用介导，使用胰岛素和 dsDNA 作为替代抗原进行多反应性 ELISA，以 3 μg/ml 在 4°C 过夜包被。用 2% BSA 封闭后，以两个浓度（5 μg/ml 和 0.5 μg/ml）测试 VHH，在 37°C 孵育 1 小时。使用 HRP 偶联抗人 IgG Fc 抗体（1:5000）、TMB 底物和 2 M H₂SO₄终止液进行检测；在 450 nm 处读取吸光度。

（以上内容摘自https://zenodo.org/records/20526590报告）