Nature | Baker团队从头设计准对称双组分蛋白纳米笼结构

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天然病毒衣壳能够通过“准对称性（quasisymmetry）”形成比严格对称结构更大的颗粒。它们利用同一种蛋白亚基在不同位置采用不同构象，从而同时构建五边形与六边形结构，实现大型二十面体衣壳的形成。虽然这种结构长期以来吸引着结构生物学家，但利用计算方法从头设计类似的准对称蛋白结构一直极具挑战。

Baker团队提出了一种基于“几何挫折（geometric frustration）”的新型计算设计策略，用于构建双组分准对称蛋白纳米笼。该系统由三聚体蛋白与二聚体连接蛋白组成，它们会自组装形成具有正曲率的局部六边形晶格。然而，六边形无法单独铺满球面，因此系统会自发引入五边形缺陷，从而驱动球形闭合结构形成。

通过设计不同局部曲率的二聚体连接蛋白，研究人员成功实现了从约 40 nm 到超过 200 nm 的蛋白纳米笼尺寸调控，其分子量从 2 MDa 一直到超过 50 MDa，已经接近天然病毒衣壳规模。

研究人员进一步对这些大型蛋白笼进行了功能化改造，使其能够装载核糖核蛋白货物并进入细胞。荧光标记后的蛋白笼还能够在哺乳动物细胞内作为流变学探针与蛋白招募平台，用于研究不同尺寸颗粒在细胞质中的扩散行为与亚细胞定位规律。该研究表明，长期以来只存在于天然病毒中的准对称结构，如今已经能够通过计算蛋白设计实现，并有望应用于生物药递送、细胞工程与合成生物学。

对称性广泛存在于自然界中，但许多复杂生物结构并不完全遵循严格对称。例如富勒烯、准晶体以及网格蛋白包被结构，都表现出一定程度的对称破缺。20 世纪 60 年代，Caspar 与 Klug 提出病毒衣壳中的“准等价（quasi-equivalence）”理论，解释了病毒如何通过局部构象变化构建大型二十面体衣壳。

传统从头蛋白设计已经能够生成规则的二十面体纳米结构，并被用于疫苗与纳米材料研究。然而，目前绝大多数人工设计结构仍局限于严格点群对称体系。真正意义上的准对称蛋白结构仍然难以实现，因为同一条蛋白序列必须在不同局部环境中采用不同构象，同时还要避免错误聚集。

研究人员认为，如果能够以可编程方式主动打破完美对称性，就有可能打开一个新的纳米材料设计空间，从而实现尺度达到细胞器甚至亚细胞水平（10–1000 nm）的复杂生物结构。

因此，研究人员提出利用“几何挫折”原理来设计能够自发闭合的准对称蛋白颗粒。与传统方法不同，他们不再尝试让单个蛋白稳定存在于多个完全不同构象，而是设计能够在局部发生柔性变化的结构模块，通过整体装配驱动局部对称性破缺。

方法

研究人员构建了一种双组分蛋白装配体系。其中，每个顶点由一个已设计好的三聚体蛋白 C3-A 占据，而每条边则由利用 RFdiffusion 生成的二聚体连接蛋白 C2-B 构成。研究人员通过控制连接蛋白的局部曲率与锥角（cone angle），来调节整个球形结构的尺寸。

设计过程中，研究人员首先在理想六边形结构中排列多个三聚体，然后让其向球心方向倾斜形成正曲率。随后，他们利用 RFdiffusion 生成不同弯曲程度的二聚体连接结构，使整个体系在局部形成弯曲六边形晶格。

由于六边形无法铺满球面，因此系统在组装过程中会自然形成五边形缺陷，从而驱动闭合球形纳米笼形成。研究人员进一步利用 ProteinMPNN 与 AlphaFold2 对设计结构进行序列优化与结构验证，并最终在大肠杆菌中表达纯化这些设计蛋白。

图1：准对称双组分蛋白纳米笼的计算设计原理示。

蛋白笼闭合过程中产生的几何挫折。

利用 RFdiffusion 计算生成 C2 连接蛋白骨架结构。

结果

研究人员利用局部曲率实现蛋白笼尺寸可编程调控

研究人员首先建立了一套利用几何挫折驱动准对称蛋白笼形成的设计框架。系统的核心思想是：通过局部弯曲六边形结构诱导整体球面闭合，而在闭合过程中自动产生五边形缺陷。

他们设计了不同曲率的 C2-B 二聚体连接模块，并通过异源二聚体界面确保 C3-A 与 C2-B 之间的特异性结合。整个体系能够像富勒烯一样，通过局部几何冲突驱动整体结构形成。

这种设计方式与天然病毒衣壳形成机制高度相似，但相比天然系统具有更强可编程性，因为蛋白界面弯曲角度可以连续调节，而不像碳原子键角那样固定。

不同锥角能够决定不同尺寸蛋白笼

研究人员随后系统测试了不同锥角设计对蛋白笼尺寸的影响。他们构建了一系列锥角从 40° 到 8° 的 C2-B 连接蛋白，对应不同曲率水平。

实验结果显示，随着锥角减小，蛋白笼尺寸明显增大。40° 锥角产生约 40 nm 的小型 T=1 十二面体结构，而 8° 锥角则形成接近 200 nm 的超大型蛋白笼，对应 T≈25 的大型准对称结构。

负染电镜分析进一步显示，所有样品中均存在明显五边形缺陷，证明系统确实通过局部对称性破缺驱动球面闭合。

研究人员还发现，当锥角低于 6° 时，局部曲率过低，体系会形成不可逆聚集，而无法稳定形成球形结构。

图2：不同锥角驱动形成不同尺寸准对称蛋白纳米笼。

冷冻电镜揭示准对称结构中的局部构象变化

为了理解这些蛋白笼的结构基础，研究人员进一步利用冷冻电镜对 T=3 与更高 T 数结构进行了分析。

在 T=3 蛋白笼中，他们获得了 2.1 Å 分辨率的 C2-B 晶体结构，并发现实验结构与设计模型高度一致。进一步的 cryo-EM 重构显示，该结构形成了类似足球的截角二十面体形态，由 12 个五边形与 20 个六边形组成。

更重要的是，研究人员发现同一个三聚体蛋白在不同局部环境中会形成不同构象。例如，位于“六边形-六边形”连接位置与“六边形-五边形”连接位置的蛋白，其末端位置差异可达到 20 Å。这说明体系真正实现了局部准对称构象变化。

对于更大型的 T≈16 与 T≈25 蛋白笼，研究人员观察到大量近球形闭合结构，同时还发现了七边形缺陷与扭曲六边形，这些现象与大型富勒烯中的拓扑缺陷高度相似。

图3：T=3 与高 T 数蛋白笼的冷冻电镜结构解析。

研究人员实现了蛋白笼的货物装载与细胞摄取

研究人员进一步探索了这些蛋白笼的生物功能化潜力。他们发现，C3-A 与 C2-B 的末端均能够方便地与其他天然蛋白或从头设计蛋白进行融合，例如荧光蛋白、纳米抗体、HaloTag、SpyTag 以及 ApoE3 等。

随后，他们构建了能够结合 GFP 的纳米抗体蛋白笼，并成功装载 GFP 标记的 Cas9 蛋白。电镜结果显示，装载后蛋白笼形态并未发生明显变化，说明体系能够稳定容纳大型核糖核蛋白货物。

研究人员还进一步引入针对不同细胞受体的 EndoTag 蛋白，使蛋白笼能够被细胞主动内吞。共聚焦成像显示，功能化蛋白笼能够成功进入 HEP3B 细胞，并部分定位于溶酶体。

不同尺寸蛋白笼的细胞摄取效率还表现出明显受体依赖性。例如，ASGPR 靶向系统更偏好较小蛋白笼，而 sortilin 靶向系统则更倾向于摄取较大颗粒。

图4：蛋白纳米笼的功能化改造、货物装载与细胞摄取。

蛋白笼能够作为细胞内流变学探针

研究人员还发现，这些可编程蛋白笼能够作为细胞内部的流变学探针，用于研究细胞质物理性质。

他们在 U2OS 细胞中表达不同尺寸的荧光蛋白笼，并利用单颗粒追踪分析其扩散行为。结果显示，颗粒扩散速度与设计尺寸呈负相关，即颗粒越大，在细胞质中扩散越慢。

此外，当研究人员利用山梨醇提高细胞内大分子拥挤程度后，所有蛋白笼扩散速度均明显下降，说明这些人工纳米结构能够敏感感知细胞内部物理环境变化。

蛋白笼能够在细胞内重新定位蛋白质

研究人员最后测试了蛋白笼对细胞内蛋白定位的调控能力。他们利用 GFP 纳米抗体将 p53 蛋白招募到蛋白笼上。

正常情况下，p53 主要位于细胞核内。但当其被招募到大型蛋白笼后，由于整体颗粒过大，无法通过核孔进入细胞核，因此大量 p53 被滞留在细胞质中。

这一结果说明，这些设计蛋白笼不仅能够装载货物，还能够主动调控细胞内蛋白分布与亚细胞定位。

研究人员认为，本研究最大的概念创新在于放弃了传统“显式多构象设计”策略，而采用一种“隐式多状态设计”方法。系统不再要求蛋白稳定存在于多个固定构象，而是利用局部柔性与整体装配驱动自发对称性破缺。

通过编码局部曲率，研究人员首次实现了从 40 nm 到超过 200 nm 的可编程准对称蛋白笼设计，其尺寸已经达到天然病毒衣壳级别。

与天然病毒相比，这些人工蛋白笼具有更高模块化程度、更强尺寸可调性以及更灵活的功能化能力。它们不仅能够作为细胞递送载体，还可用于细胞流变学研究、空间蛋白组学、CryoET 标记以及合成生物学。

研究人员认为，这项工作为下一代可编程生物材料奠定了基础，并可能推动细胞递送、代谢工程与人工细胞器等领域的发展。

整理 | DrugOne团队